免疫組化的實驗方法及操作流程
（1）脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鍾或60℃恒溫箱中烘烤20分鍾。

1）組織芯片置於(yu) 二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；

2）無水乙醇中浸泡5分鍾；

3）95%乙醇中浸泡5分鍾；

4）70%乙醇中浸泡5分鍾；

（2）抗原修複

用於(yu) 福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。

1）抗原熱修複

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩衝(chong) 溶液（pH6.0）。蓋上不鏽鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於(yu) 金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩衝(chong) 液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會(hui) 升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於(yu) 較難檢測或核抗原的抗原修複。

2）煮沸熱修複

電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩衝(chong) 溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鍾。

3）微波熱修複

在微波爐裏加熱0.01M枸櫞酸鈉緩衝(chong) 溶液（pH6.0）至沸騰後將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鍾，反複1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heatshockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

4）酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為(wei) 5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為(wei) 30分鍾。適用於(yu) 被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

（3）免疫組織化學染色

常見的染色方法有兩(liang) 種：SP法，SABC法。以下分別列出兩(liang) 種方法的實驗步驟。

SP法

1）脫蠟、水化；

2）PBS洗2~3次各5分鍾；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾

4）PBS洗2~3次各5分鍾；

5）抗原修複；

6）PBS洗2~3次各5分鍾；

7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘(yu) 液體(ti) 。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃或者37℃1小時。

9）4℃後需在37℃複溫45分鍾。

10）PBS洗3次各5分鍾；

11）滴加Ⅱ抗40~50μl,室溫靜置，或37℃1小時；

12）抗中可加入0.05%的tween-20.

13）BS洗3次各5分鍾；

14）DAB顯色5~10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；

15）PBS或自來水衝(chong) 洗10分鍾；

16）蘇木精複染2分鍾，鹽酸酒精分化；

17）自來水衝(chong) 洗10~15分鍾；

18）脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1）脫蠟、水化。

2）PBS洗兩(liang) 次各5分鍾。

3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5~10分鍾，蒸餾水洗3次。

4）抗原修複。

5）PBS洗5分鍾。

6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘(yu) 液體(ti) 。

7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃或者37℃1小時（4℃後在37℃複溫45分鍾）。

8）PBS洗三次每次2分鍾。

9）滴加生物素化二抗，20℃~37℃20分鍾。

10）PBC洗3次每次2分鍾。

11）滴加試劑SABC，20℃~37℃20分鍾。

12）PBS洗4次每次5分鍾。

13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14）蒸餾水洗。蘇木素複染2分鍾、鹽酸酒精分化。

15）脫水、透明、封片、鏡檢。