液氮超低溫保藏技術分析

操作步驟如下：
1 安瓿管或凍存管的準備
用圓底硼矽玻璃製品的安瓿管，或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗幹淨， 121℃下高壓滅菌15-20分鍾，備用。
2 保護劑的準備
保護劑種類要根據微生物類別選擇。配製保護劑時，應注意其濃度，一般采用10-20%甘油。
3 微生物保藏物的準備
微生物不同的生理狀態對存活率有影響，一般使用靜止期或成熟期培養(yang) 物。
分裝時注意應在無菌條件下操作。
菌種的準備可采用下列幾種方法：
刮取培養(yang) 物斜麵上的孢子或菌體(ti) ，與(yu) 保護劑混勻後加入凍存管內(nei) ；
接種液體(ti) 培養(yang) 基，振蕩培養(yang) 後取菌懸液與(yu) 保護劑混合分裝於(yu) 凍存管內(nei) ；
將培養(yang) 物在平皿培養(yang) ，形成菌落後，用無菌打孔器從(cong) 平板上切取一些大小均勻的小塊（直徑約5-10毫米），真菌取菌落邊緣的菌塊，與(yu) 保護劑混勻後加入凍存管內(nei) ；
在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yang) 基，接種菌種，培養(yang) 2-10天後，加入保護劑，待保藏。
4 預凍
預凍時一般冷凍速度控製在以每分鍾下降1℃為(wei) 好、使樣品凍結到-35℃。
目前常用的有三種控溫方法：
—— 程序控溫降溫法，應用電子計算機程序控製降溫裝置，可以穩定連續降溫，能很好地控製降溫速率。
—— 分段降溫法：將菌體(ti) 在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻，或懸掛於(yu) 冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫，將安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時，然後取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鍾下降1-1.5℃。
—— 對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。
5 保藏
將安瓿管或塑料凍存管置於(yu) 液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為(wei) -150℃，液相中溫度為(wei) -196℃。
6 複蘇方法
從(cong) 液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管，應立即放置在38℃-40℃水浴中快速複蘇並適當搖動。直到內(nei) 部結冰全部溶解為(wei) 止，一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nei) 容物移至適宜的培養(yang) 基上進行培養(yang) 。