1）將特異性抗體(ti) 與(yu) 固相載體(ti) 聯結，形成固相抗體(ti) 。洗滌除去未結合的抗體(ti) 及雜質。 
2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與(yu) 固相抗體(ti) 結合，形成固相抗原抗體(ti) 複合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體(ti) ，保溫反應。固相免疫複合物上的抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 結合。*洗滌未結合的酶標抗體(ti) 。此時固相載體(ti) 上帶有的酶量與(yu) 標本中受檢抗原的量相關(guan) 。 
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為(wei) 有色產(chan) 物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨(lin) 床檢驗中，此法適用於(yu) 檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。隻要獲得針對受檢抗原的異性抗體(ti) ，就可用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物而建立此法。如抗體(ti) 的來源為(wei) 抗血清，包被和酶標用的抗體(ti) 分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體(ti) ，一般選擇兩(liang) 個(ge) 針對抗原上不同決(jue) 定簇的單抗，分別用於(yu) 包被固相載體(ti) 和製備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體(ti) 一起保溫反應，作一步檢測。 
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成 "夾心複合物"。類同於(yu) 沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於(yu) 抗原過剩帶上）與(yu) 標準曲線（位於(yu) 抗體(ti) 過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於(yu) 實際的含量，這種現象被稱為(wei) 鉤狀效應（hook effect），因為(wei) 標準曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴(yan) 重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等）時，應注意可測範圍的zui高值。用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) 製備此類試劑可削弱鉤狀效應。 
假使在被測分子的不同位點上含有多個(ge) 相同的決(jue) 定簇，例如 HBsAg 的a 決(jue) 定簇，也可用針對此決(jue) 定的同一單抗分別包被固相和製備酶結合物。但在HBsAg 的檢測中應注意亞(ya) 型問題，HBs Ag 有adr、adw、ayr 、ayw4 個(ge) 亞(ya) 型，雖然每種亞(ya) 型均有相同的a 決(jue) 定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。 
雙抗體(ti) 夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（ RF）的幹擾。RF 是一種自身抗體(ti) ，多為(wei) IgM 型，能和多種動物IgG 的Fc 段結合。用作雙抗體(ti) 夾心法檢測的血清標本中如含有R F，它可充當抗原成份，同時與(yu) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 結合，表現出假陽性反應。采用F（ab’）或Fab 片段作酶結合物的試劑，由於(yu) 去除了Fc 段，從(cong) 而消除RF 的幹擾。雙抗體(ti) 夾心法ELISA 試劑是否受RF 的影響，已被列為(wei) 這類試劑的一項考核指標。 
雙抗體(ti) 夾心法適用於(yu) 測定二價(jia) 或二價(jia) 以上的大分子抗原，但不適用於(yu) 測定半抗原及小分子單價(jia) 抗原，因其不能形成兩(liang) 位點夾心。