戊二醛二步法

1) 原理：戊二醛為(wei) 一種雙功能試劑，通過其醛基分別與(yu) 酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jia) 結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

2)標記步驟：

(1) 稱取HRP25mg溶於(yu) 1.25%戊二醛溶液中，於(yu) 室溫靜置過一夜。

(2) 反應後的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控製在1ml/1分鍾，收集棕色流出液。如體(ti) 積大於(yu) 5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3) 將待標記的抗體(ti) 12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸緩衝(chong) 液0.25ml，繼續攪拌3?小時。)

(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。

(6) 在攪拌下逐滴加入等體(ti) 積飽和硫酸銨，置4℃1小時。

(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，zui後沉澱物溶於(yu) 少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩衝(chong) 鹽水透析，去除銨離子後(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鍾去除沉澱，上清液即為(wei) 酶結合物，分裝後，冰凍保存。