親(qin) 和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個(ge) 分子由4個(ge) 亞(ya) 基組成,可以和4個(ge) 生物素分子親(qin) 密結合。生物素在人體(ti) 內(nei) 是不能單獨起作用的,它需要與(yu) 其他酶、氨基酸脂肪衍生物等結合來綜合調控。生物素結合常數即表示了它與(yu) 其他有機分子結合能力的大小。
現在使用更多的是從(cong) 鏈黴菌中提取的鏈親(qin) 和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在於(yu) 蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞(ya) 胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與(yu) 蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chan) 物。親(qin) 和素與(yu) 生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親(qin) 和力大,兩(liang) 者一經結合就極為(wei) 穩定。由於(yu) 1個(ge) 親(qin) 和素分子有4個(ge) 生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的複合體(ti) 。因此把親(qin) 和素和生物素與(yu) ELIS偶聯起來,就可大提高ELISA的敏感度。
親(qin) 合素主要包括卵白親(qin) 合素、鏈親(qin) 合素、卵黃親(qin) 合素及類親(qin) 合素等。後兩(liang) 種因其特異性親(qin) 合力低,研究不多,前兩(liang) 種目前已深入研究並得到廣泛應用:
1、卵白親(qin) 和素:親(qin) 合素又稱卵白蛋白或抗生物素,分子量為(wei) 68000,pI 10~10.5;在pH9~13緩衝(chong) 液中性質均穩定,耐熱並耐多種蛋白水解酶的作用。天然親(qin) 合素為(wei) 堿性蛋白,由4個(ge) 相同的亞(ya) 單位構成4聚體(ti) ;每個(ge) 親(qin) 合素亞(ya) 單位通過其結構中的色氨酸殘基與(yu) 生物素中的Ureido環(I環)結合。因此,1個(ge) 親(qin) 合素分子存在4個(ge) 與(yu) 生物素分子結合位點,其結合常數(Ka)高 達1015mol/L。通常,親(qin) 合素的活性單位是以親(qin) 合素結合生物素的量來表示的,即以能結合1Pg生物素所需要的親(qin) 合素量為(wei) 1個(ge) 親(qin) 合素活性單位。一般1Pg親(qin) 合素約含13~15個(ge) 活性單位。
2、鏈黴親(qin) 和素:鏈黴親(qin) 合素(SA)是與(yu) 親(qin) 合素(A)有類似生物學特性的一種蛋白質。是由Streptomyces avidin菌在培養(yang) 過程中分泌的一種蛋白質產(chan) 物,SA也可通過基因工程手段。SA分子量為(wei) 65000,由4條序列相同的肽鏈構成,每條SA肽鏈可以結合1個(ge) 生物素分子。因此與(yu) A一樣,每個(ge) SA分子也具有4個(ge) 可與(yu) 生物素分子結合位點,其結合常數與(yu) A相同為(wei) 1015mol/L。約為(wei) 抗原抗體(ti) 間ka(105~1011 mol/L)的1萬(wan) 倍以上。SA與(yu) A的ka雖然相同,但在實際應用中其檢測靈敏度明顯優(you) 於(yu) A,其原因是SA為(wei) 略偏酸性的蛋白。SA的每條肽鏈含159個(ge) 氨基酸殘基,其中賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的含量比一般親(qin) 合素少,反之含酸性氨基酸較多,其等點為(wei) 6.0,較A(pI=10)為(wei) 低,同時在結構中SA不含任何糖基,而A含糖可高達10%。A的高pI及高含糖結構導致在聚苯乙烯板和硝酸纖維素膜上或與(yu) 組織細胞DNA結合時,易產(chan) 生一定程度的非特異性結合,造成較高的顯色背景,而SA較A在應用中明顯克服了這一缺點。