1.固相載體(ti) 的選擇：許多物質可作為(wei) 固相載體(ti) ，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體(ti) ，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
2.包被抗體(ti) （或抗原）的選擇：將抗體(ti) （或抗原）吸附在固相載體(ti) 表麵時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的zui適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。對於(yu) 多數蛋白質來說通常為(wei) 1～10μg/ml。
3.酶標記抗體(ti) 工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價(jia) 的滴定（見酶標記抗體(ti) 部份）。然後再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體(ti) 分別為(wei) 不同的稀釋度）在正式實驗係統裏準確地滴定其工作濃度。
4.酶的底物及供氫體(ti) 的選擇：對供氫體(ti) 的選擇要求是價(jia) 廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(ti) （如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體(ti) ，如TMB和ABTS是目前較為(wei) 滿意的供氫體(ti) 。底物作用一段時間後，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為(wei) 宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨(lin) 用前加入。