一、臨(lin) 床標本的收集和保存
用於(yu) ELISA測定的臨(lin) 床標本zui為(wei) 常用的是血清（漿），有時因為(wei) 特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨(lin) 床上使用血清標本測定的標誌物一般有傳(chuan) 染性病原體(ti) 的抗原和抗體(ti) 、腫瘤標誌物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用於(yu) 激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體(ti) 位有可能會(hui) 對測定結果產(chan) 生影響。如可的鬆在早晨4～6點之間，會(hui) 有一峰值出現：生長激素、促黃體(ti) 激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內(nei) 采取數份血樣本，以其中間值為(wei) 測定值。又如當從(cong) 臥位變為(wei) 站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥後的zui適時間抽血檢測。用於(yu) 傳(chuan) 染性病原體(ti) 的抗原和抗體(ti) 、腫瘤標誌物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體(ti) 位方麵的影響，隻是在處理和保存方麵要考慮以下幾個(ge) 方麵：
（1）要注意避免出現嚴(yan) 重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為(wei) 標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附於(yu) 固相，從(cong) 而與(yu) 後麵加入的HRP底物反應顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌汙染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會(hui) 對抗原抗體(ti) 等蛋白產(chan) 生分解作用；二則一些細菌的內(nei) 源性酶如大腸杆菌的β-半乳糖苷酶本身會(hui) 對用相應酶作標記的測定方法產(chan) 生非特異性幹擾。
（3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為(wei) 有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。
（4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反複凍融。標本的反複凍融所產(chan) 生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chan) 生破壞作用，從(cong) 而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反複顛倒混勻即可。
（5）標本在保存中如出現細菌汙染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉澱後取上清檢測。
二、試劑準備
在臨(lin) 床實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從(cong) 冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響後麵溫育時間不夠的問題，其直接的後果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備zui為(wei) 關(guan) 鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從(cong) 冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鍾以上後，再進行測定，以使試劑盒在使用前與(yu) 室溫平衡。這樣做的目的，主要是為(wei) 了在後麵的溫育反應步驟中，能使反應微孔內(nei) 的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品xl18luck新利中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配製，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為(wei) 底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨(lin) 時配製。
三、加血清樣本及反應試劑
在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎醫學教育網是*的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guan) 鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chan) 生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會(hui) 對鄰近孔產(chan) 生汙染。出現氣泡則反應液界麵有差異。試劑的加入在國產(chan) 試劑盒中基本上均是從(cong) 滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重複滴加或加在兩(liang) 孔之間的現象，這樣就會(hui) 在孔內(nei) 的非包被區出現非特異吸附，從(cong) 而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為(wei) 陽性，下次測定為(wei) 陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。
四、溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗zui為(wei) 關(guan) 鍵的一個(ge) 因素。ELISA作為(wei) 一種固相免疫測定，抗原抗體(ti) 的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體(ti) 與(yu) 固相上的特異抗體(ti) 或抗原*結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與(yu) 溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。zui為(wei) 常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是臨(lin) 床ELISA測定中zui容易出現問題的步驟。通常目前國內(nei) ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為(wei) 37℃ 30分鍾～1小時，進口xl18luck新利則通常為(wei) 37℃ 1～2小時才能有較*的結合，低於(yu) 1小時，可能會(hui) 影響測定下限。因此，關(guan) 於(yu) 溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：
要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑後，將微孔板從(cong) 室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nei) 溫度從(cong) 室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨(lin) 床實驗室中，很少有人注意這個(ge) 問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個(ge) 問題，就是在每一年的冬季總有那麽(me) 一個(ge) 多月的時間，在做HBsAg測定的室內(nei) 質控中，測定由衛生部臨(lin) 床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為(wei) 何？這可能就與(yu) 南方冬天室內(nei) 溫度較低有關(guan) ，此時微孔板轉入溫箱後37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為(wei) 陰性。因此，為(wei) 保證37℃下足夠的溫育時間，臨(lin) 床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從(cong) 室溫拿至溫箱後需要多長時間孔內(nei) 溫度才能達到37℃，從(cong) 而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體(ti) 的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液醫學教育網中測量觀察即可。