本試劑僅(jin) 供研究使用 標本：血清或血漿

試驗原理：
T4試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知T4濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nei) 進行檢測。先將T4和生物素標記的抗體(ti) 同時溫育。洗滌後，加入親(qin) 和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然後加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產(chan) 生顏色。顏色的深淺和樣品中T4的濃度呈比例關(guan) 係。

試劑盒內(nei) 容及其配製
試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配製
96/48人份酶標板 1塊板（96T） 半塊板（48T） 即用型
塑料膜板蓋 1塊 半塊 即用型
標準品：800nmol/L 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明書(shu) 進行稀稀
空白對照 1瓶（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型
標準品稀釋緩衝(chong) 液 1瓶（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型
生物素標記的抗T4抗體(ti) 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
親(qin) 和鏈酶素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用型
洗滌緩衝(chong) 液 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按說明書(shu) 進行稀釋
底物A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
終止液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型
標本稀釋液 1瓶（12ml） 1瓶（6.0ml） 即用型

自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體(ti) ，請盡快用水衝(chong) 洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒裏的任何成份。

操作注意事項
1． 試劑應按標簽說明書(shu) 儲(chu) 存，使用前恢複到室溫。稀稀過後的標準品應丟(diu) 棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉汙染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用幹淨的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應充分拍幹，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露於(yu) 光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成後應立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書(shu) 中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管。收集血液後，1000×g離心10分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於(yu) 檢測。1000×g離心30分鍾去除顆粒。
3、 細胞上清液---1000×g離心10分鍾去除顆粒和聚合物。
4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鍾，取上清液
5、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反複冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1． 標準品：標準品的係列稀釋應在實驗時準備，不能儲(chu) 存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
800 nmol/L （6號標準品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400 nmol/L （5號標準品） 100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
200 nmol/L （4號標準品） 100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
100 nmol/L （3號標準品） 100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
50 nmol/L （2號標準品） 100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
25 nmol/L （1號標準品） 100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 nmol/L （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩衝(chong) 液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體(ti) 產(chan) 生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chan) 生加樣上的誤差。
2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決(jue) 定所需的板條數。每個(ge) 標準品和空白孔建議做複孔。每個(ge) 樣品根據自己的數量來定，能使用複孔的盡量做複孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋後加入50ul於(yu) 反應孔內(nei) 。
3． 加入稀釋好後的標準品50ul於(yu) 反應孔、加入待測樣品50ul於(yu) 反應孔內(nei) 。立即加入50ul的生物素標記的抗體(ti) 。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5． 每孔加入80ul的親(qin) 和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鍾。
6． 甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鍾。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液後應立即測定結果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案
標準品濃度（nmol/L）
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 100 100 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限
6號標準品以上的結果為(wei) 非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。

試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小於(yu) 1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值為(wei) 0.990。
2. 特異性：不與(yu) 其它細胞因子反應。
3. 重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 10%。

結 果 判 斷 與(yu) 分 析
1、儀(yi) 器值：於(yu) 波長450nm的酶標儀(yi) 上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為(wei) 縱坐標（Y），相應的T4標準品濃度為(wei) 橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的T4含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。

3、檢測值範圍：0-800nmol/L

4、敏感度： 1.0 nmol/L