實時熒光定量PCR技術
實時熒光定量PCR原理
所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體(ti) 係中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個(ge) PCR進程，zui後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
在技術中，有一個(ge) 很重要的概念 -- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義(yi) 是：每個(ge) 反應管內(nei) 的熒光信號到達設定的域值時所經曆的循環數（如圖1所示）。
PCR反應的前15個(ge) 循環的熒光信號作為(wei) 熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個(ge) 循環的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
研究表明，每個(ge) 模板的Ct值與(yu) 該模板的起始的對數存在線性關(guan) 係〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值（如圖2所示）。因此，隻要獲得未知樣品的Ct值，即可從(cong) 標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為(wei) 兩(liang) 種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個(ge) 特異性的熒光探針，該探針為(wei) 一寡核苷酸，兩(liang) 端分別標記一個(ge) 報告熒光基團和一個(ge) 淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從(cong) 而熒光監測係統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(ge) 熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與(yu) PCR產(chan) 物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為(wei) 基因診斷和個(ge) 體(ti) 化用藥分析的技術平台。
2）SYBR熒光染料：在PCR反應體(ti) 係中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(hui) 發射任何熒光信號，從(cong) 而保證熒光信號的增加與(yu) PCR產(chan) 物的增加*同步。
1）內(nei) 參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nei) 標和引物，內(nei) 標用基因工程方法合成。用熒光標記，下遊引物不標記。在模板擴增的同時，內(nei) 標也被擴增。在PCR產(chan) 物中，由於(yu) 內(nei) 標與(yu) 靶模板的長度不同，二者的擴增產(chan) 物可用電泳或液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nei) 標為(wei) 對照定量待檢測模板。
2）競爭(zheng) 法：選擇由突變克隆產(chan) 生的含有一個(ge) 新內(nei) 切位點的外源競爭(zheng) 性模板。在同一反應管中，待測樣品與(yu) 競爭(zheng) 模板用同一對引物同時擴增（其中一個(ge) 引物為(wei) 熒光標記）。擴增後用內(nei) 切酶消化PCR產(chan) 物，競爭(zheng) 性模板的產(chan) 物被酶解為(wei) 兩(liang) 個(ge) 片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩(liang) 種產(chan) 物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chan) 物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體(ti) －辣根過氧化物酶結合物，zui終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法隻是定性實驗，若加入內(nei) 標，作出標準曲線，也可實現定量檢測目的。
實時熒光定量PCR技術
2．內(nei) 標在傳(chuan) 統定量中的作用
由於(yu) 傳(chuan) 統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個(ge) 模板在96孔PCR儀(yi) 上做96次重複實驗，所得結果有很大差異（見圖4），因此無法直接從(cong) 終點產(chan) 物量推算出起始模板量。加入內(nei) 標後，可部分消除終產(chan) 物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳(chuan) 統的定量方法也都隻能算作半定量、粗略定量的方法。
有效地解決(jue) 了傳(chuan) 統定量隻能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在之中，通過對每個(ge) 樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nei) 標是建立在兩(liang) 個(ge) 基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nei) 擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與(yu) 起始模板的線性關(guan) 係由於(yu) Ct值與(yu) 起始模板的對數存在線性關(guan) 係，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內(nei) 標，則PCR反應變為(wei) 雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩(liang) 種模板之間的幹擾和競爭(zheng) ，尤其當兩(liang) 種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭(zheng) 會(hui) 表現得更為(wei) 顯著。但由於(yu) 待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為(wei) 內(nei) 標。也正是這個(ge) 原因，傳(chuan) 統定量方法雖然加入內(nei) 標，但仍然隻是一種半定量的方法。
Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nei) 標法定量的方法學比較，得出的結論是：內(nei) 標法作為(wei) 定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方。
實時熒光定量PCR儀(yi) 是*的熒光定量PCR的金標準，可實現多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標準曲線的方法，而不用內(nei) 標進行定量。
綜上所述，利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為(wei) 止定量zui準確，重現性的定量方法，已得到*的*，廣泛用於(yu) 基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體(ti) 檢測等諸多領域。
熒光PCR是分子診斷的熱點技術，它將先進的定量PCR與(yu) 實時PCR技術相結合，國產(chan) 實時熒光定量PCR儀(yi) 為(wei) 肝炎艾滋病等重大疾病的定量核酸檢測及分子診斷、同時也為(wei) 沙門氏菌等食品安全檢測提供了先進手段。即使在發達國家，熒光定量PCR儀(yi) 和都被廣泛用於(yu) 臨(lin) 床及生物學、醫學研究。由於(yu) 其*的靈敏度、極寬的檢測範圍，以及定量、方便快速、無窗口期等優(you) 點，美國FDA及我國已將定量PCR儀(yi) 規定為(wei) 確診禽流感等傳(chuan) 染病以及奶粉等食品安全檢測的*儀(yi) 器。
實時熒光定量PCR儀(yi) （real-time qPCR）的發明實現了榮獲的PCR核酸檢測、分子診斷的技術飛躍。
臨(lin) 床疾病診斷：
各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳(chuan) 染病診斷和療效評價(jia) ；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合症、胎兒(er) 畸形等優(you) 生優(you) 育檢測；腫瘤標誌物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳(chuan) 基因檢測實現遺傳(chuan) 病診斷。
禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線杆菌、寄生蟲病等、。
食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業(ye) 等檢測。
醫學、農(nong) 牧、生物相關(guan) 分子生物學定量研究。
各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸(shou) 醫站、食品企業(ye) 及乳品廠等。
由於(yu) qPCR是實時定量檢測致病病原體(ti) 基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白芯片等免疫學方法更具獨到優(you) 勢。
標記有熒光素的Taqman探針與(yu) 模板DNA混合後，完成高溫變性，低溫複性，適溫延伸的熱循環，並遵守規律，與(yu) 模板DNA互補配對的Taqman探針被切斷，熒光素遊離於(yu) 反應體(ti) 係中，在特定光激發下發出熒光，隨著循環次數的增加，被擴增的目的基因片段呈指數規律增長，通過實時檢測與(yu) 之對應的隨擴增而變化熒光信號強度，求得CT值，同時利用數個(ge) 已知模板濃度的標準品作對照，即可得出待測標本目的基因的拷貝數。
標本載體(ti)
0.2ml薄壁PCR離心管
標本數量
標本數量36個(ge) ，包括4個(ge) 標準品
試 劑
SYBR Green I，FAM，Tex Red，FITC等熒光染料，開放式PCR試劑
反應體(ti) 係
10-100μL
建議質控
四個(ge) 陽性標準品、陰性對照
指標
熒光激發波長
470nm
熒光發射波長
530nm，640nm，710nm
570nm，605nm
熒光檢測方式
光開關(guan) 陣列組合光電倍增管PMT方式
控溫範圍
4.0℃-99.0℃
熱蓋溫度
100℃～120℃
升/降溫速度
≥4.0℃/S（Max）
溫度均勻性
≤±0.3℃
溫度度
≤±0.3℃
溫度顯示精度
0.1℃
檢測範圍
101～1010DNA/RNA copy/ml
CT值重複性誤差
CV≤2.1％
核酸精度相關(guan) 係數
R≥0.997
溫階
1～9
循環
1～99
保溫時間
1～9999秒
文件
1～9個(ge) 連接
升級方式
遠程硬件內(nei) 控軟件升級
係統接口
串行接口，雙向數據
Windows2000/XP
產(chan) 品外形尺寸
50cm × 40cm × 35cm
產(chan) 品重量
25kg
使用環境
溫度5～40℃，相對濕度≤80％
使用電源
AC220 × （1±10%）V,50 × （1±2%）HZ
功耗
1100VA
多規格
提供96孔，多通道/多色、36孔等不同規格產(chan) 品
技術應用實現快速均衡擴增檢測由光開關(guan) 陣列、自聚焦透鏡和尾纖準直器及變增益微光O/E裝置組成的MEMS有機整體(ti) ，在以16位單片機為(wei) 核心的電控裝置管理下，能在毫秒級時間內(nei) 完成多個(ge) 標本快速均衡掃描檢測，避免了機械掃描方式或CCD掃描方式引起的時間滯後或漸暈誤差。實現標準樣本的PCR熱循環擴增及高通量實時熒光激發和定量檢測。
產(chan) 品突出特性
« 走在PCR技術的前列
在PCR儀(yi) 和市場化領域中曆史悠久；
將標準化的PCR檢測技術成功廣泛用於(yu) 臨(lin) 床；
« 快速實時PCR技術實現了DNA/mRNA檢測的快速性
實時檢測啟用熒光探針標記特定核酸的方法使準確性更高；
簡化了傳(chuan) 統PCR方法；
使用zui少的樣本量，在一小時左右出結果；
« 簡便閉管分析使您完成加樣後就無須再接觸樣本
減少樣本消耗殆盡風險；
縮短了出報告時間；
簡化了試驗步驟；
« 提高了用戶應用的靈活性
提供了用戶自定義(yi) PCR操作平台；
建立您的用戶自定義(yi) 應用；
分析用戶自定義(yi) 試驗；
« 高性能
高靈敏度；
高特異性；
寬的動態範圍；
« 強大的軟件數據管理係統
完整的病例檔案；
集成化的網絡服務功能；
圖標顯示；
自動試劑及結果跟蹤；
客戶使用界麵友好；
« 開放式、個(ge) 性化儀(yi) 器易於(yu) 適應您的實驗室環境
« 免維護光源係統
高亮度窄帶LED光源，工作穩定，使用壽命長，終身免維護
« 靈敏的光電係統
熒光激發/檢測單色器采用美國原產(chan) 濾光片；檢測器采用原產(chan) 金屬封裝式光電倍增管PMT，具有靈敏度高、快速、穩定的特點；準直器、光開光陣列、光纖組件、電控裝置全部采用進口期間；精度高，一致性好。
« 先進的溫控係統
本儀(yi) 器采用膜加熱及半導體(ti) 熱泵製冷技術保證了升降溫的快速穩定、儀(yi) 器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為(wei) 原因造成的汙染。
« 先進的溫控係統
本儀(yi) 器采用膜加熱及半導體(ti) 泵製冷技術保證了升降溫的快速穩定、儀(yi) 器壽命長的特點，加有熱蓋保證了PCR無礦物油操作，避免了人為(wei) 原因造成的汙染。
« 友好的軟件係統
中文Windows傳(chuan) 統界麵更符合國人操作習(xi) 慣，多個(ge) 標準參數填空式輸入降低了因參數設置所造成的事物；參數輸入提示保證了參數輸入的有效性。
« 多樣化的運行方式
每個(ge) 程序段數多達9個(ge) ；每個(ge) 程序的步驟多達9個(ge) ；每個(ge) 程序的循環數多達99個(ge) ，溫度、循環等多個(ge) 參數的多種修正、調節方式，可*臨(lin) 床及科研上試驗的要求。
« 良好的線性範圍、靈敏度、重複性
線性範圍廣、可檢測的樣品濃度線性範圍101～1010，靈敏度zui小分辨率為(wei) 1拷貝，重複性CV≤2.1%。
« *的瞬時
瞬時停電後本儀(yi) 器可提醒用戶繼續試驗。因電網或其他或其他原因造成的短暫瞬時停電不再會(hui) 給您的實驗帶來麻煩，為(wei) 您減少試劑的損耗，解除您沒有專(zhuan) 線電源的顧慮。
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