人癌胚抗原（CEA/CD66）酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書(shu)
本試劑盒僅(jin) 供研究使用
產(chan) 品編號：CSB-E04767h
檢測範圍：0.156 ng/ml - 10 ng/ml
zui低檢測限：0.039 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人CEA，且與(yu) 其他相關(guan) 蛋白無交叉反應。
有效期：6個(ge) 月
預期應用：ELISA法定量測定人血清、血漿、細胞培養(yang) 上清或其它相關(guan) 生物液體(ti) 中CEA含量。
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。
2．濃洗滌液低溫保存會(hui) 有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3．中、英文說明書(shu) 可能會(hui) 有不一致之處，請以英文說明書(shu) 為(wei) 準。
4．剛開啟的酶聯板孔中可能會(hui) 含有少許水樣物質，此為(wei) 正常現象，不會(hui) 對實驗結果造成任何影響。
實驗原理
用純化的抗體(ti) 包被微孔板，製成固相載體(ti) ，往包被抗CEA抗體(ti) 的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗CEA抗體(ti) 、HRP標記的親(qin) 和素，經過*洗滌後用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的CEA呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配製
1. 酶聯板（Assay plate ）：一塊（96孔）。
2. 標準品（Standard）：2瓶（凍幹品）。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。
4. 生物素標記抗體(ti) 稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。
5. 辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。
6. 生物素標記抗體(ti) （Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
7. 辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標準規格酶標儀(yi)
2. 高速離心機
3. 電熱恒溫培養(yang) 箱
4. 幹淨的試管和Eppendof管
5. 係列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請於(yu) 室溫放置2小時或4℃過夜後於(yu) 1000g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將標本放於(yu) -20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為(wei) 抗凝劑，標本采集後30分鍾內(nei) 於(yu) 2 - 8°C 1000 g離心15分鍾，或將標本放於(yu) -20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
3. 細胞培養(yang) 物上清或其它生物標本：1000g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將標本放於(yu) -20℃或-80℃保存，但應避免反複凍融。
注：標本溶血會(hui) 影響zui後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
標本的稀釋原則：
首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。隻有稀釋至標準曲線的範圍內(nei) ，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。zui後計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。
標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨(lin) 用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後靜置10分鍾以上，然後反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 10 ng/ml，做係列倍比稀釋後，分別稀釋10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，樣品稀釋液直接作為(wei) 標準濃度0 ng/ml，臨(lin) 用前15分鍾內(nei) 配製。
如配製5 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少於(yu) 0.5ml）10 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。
人癌胚抗原（CEA/CD66）酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書(shu)
生物素標記抗體(ti) 的稀釋原則：
臨(lin) 用前以生物素標記抗體(ti) 稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100μl），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體(ti) 加990μl生物素標記抗體(ti) 稀釋液的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製。
辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素的稀釋原則：
臨(lin) 用前以辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（每孔100μl），實際配製時應多配製0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素加990μl辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素稀釋液 的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製。
操作步驟
實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測範圍。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，餘(yu) 孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鍾。
為(wei) 保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體(ti) ，甩幹，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體(ti) 工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體(ti) 加99μl生物素標記抗體(ti) 稀釋液的比例配製，輕輕混勻，在使用前一小時內(nei) 配製），37℃,60分鍾。
3. 溫育60分鍾後，棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板3次，每次浸泡1-2分鍾，200μl/每孔，甩幹。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素工作液（同生物素標記抗體(ti) 工作液） 100μl，37℃，60分鍾。
5. 溫育60分鍾後，棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板5次，每次浸泡1-2分鍾，200μl/每孔，甩幹。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鍾內(nei) ，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，後3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與(yu) 底物液的加入順序相同。為(wei) 了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到後應盡快加入終止液。
8. 用酶聯儀(yi) 在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液後15分鍾以內(nei) 進行檢測。
注：
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鍾，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為(wei) 空白調零孔，該孔不加任何試劑，隻是zui後加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。
3. 為(wei) 防止樣品蒸發，試驗時將反應板放於(yu) 鋪有濕布的密閉盒內(nei) ，酶標板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標板或者試劑，請於(yu) 2-8℃保存。標準品、生物素標記抗體(ti) 工作液、辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重複使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體(ti) 工作液、或辣根過氧化物酶標記親(qin) 和素工作液。
5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。
人癌胚抗原（CEA/CD66）酶聯免疫分析
試劑盒使用說明書(shu)
洗板方法
計算
以標準物的濃度為(wei) 橫坐標（對數坐標），OD值為(wei) 縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。
注意事項
1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。
2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
3. 一次加樣時間控製在5分鍾內(nei) ，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做複孔。
5. 如標本中待測物質含量過高，請先稀釋後再測定，計算時請zui後乘以稀釋倍數。
6. 在配製標準品、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配製，不能混淆。
7. 底物請避光保存。
8. 不要用其它的試劑替換試劑盒中的試劑。
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