蛋白質的分離純化方法
沉澱法：原理：是使蛋白質膠體(ti) 顆粒的表麵水化膜或表麵電荷破壞，從(cong) 而使蛋白質沉澱。
• 鹽析法
• 有機溶劑沉澱法
• 等點電沉澱法
• 選擇性變性沉澱法
• 聚合物沉澱法
在生物大分子製備中zui常用的幾種沉澱方法是：
• 中性鹽沉澱（鹽析法）：zui大的特點是環境溫和，不易造成蛋白質變性。因此適用於(yu) 各種蛋白質和酶的分離純化。缺點是分辨率底，且後續處理時需要除鹽。
• 有機溶劑沉澱：分辨率高於(yu) 鹽析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用於(yu) 生物小分子的分離純化比如多肽、寡肽。
• 等電點沉澱：其局限是，須事先了解蛋白的PI；且沉澱過程中可能發生變性和失活，部分蛋白等電點沉澱後不容易溶解，因此較少用於(yu) 目的蛋白的沉澱。用於(yu) 氨基酸、蛋白質及其他兩(liang) 性物質的沉澱，但此法單獨應用較少，多與(yu) 其他方法結合使用。
• 選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸堿變性沉澱）：多用於(yu) 除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。三氯yi醚是比較常用的酸變性劑，尤其在分析樣品的濃縮而不需考慮活性的條件下用得多。
• 有機聚合物沉澱：是發展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作為(wei) 沉澱劑，常用PEG6000和20000。它條件溫和，不易變性，且沉澱效果強，很少量的PEG可沉澱大量的蛋白。缺點是PEG除去比較困難。
根據分子大小不同：超濾法、透析法（膜分離法）、超速離心法、 凝膠過濾法（GF）也稱大小排阻層析，是一種根據分子的大小和形狀來進行分離的方法。不同的蛋白質分子通過凝膠微孔時因遷移能力不同而被分離。利用有一定孔徑範圍的多孔凝膠作為(wei) 固定相，（在其分離範圍內(nei) ）按分子大小將樣品中各組份分離開來。大分子先被洗脫，小分子後被洗脫。應用：脫鹽 Sephadex G10、25，中間純化 Sephadex G200，精純 Sephacryl 、Superdex。常用填料：Sephadex係：是以氯代環氧丙烷進行交聯的葡聚糖珠狀凝膠，經典的凝膠介質。Sepharose係:經過純化的瓊脂糖，含極少的帶電集團。型號zui多、應用zui廣。Sephacryl係：有是丙基葡聚糖與(yu) N,N’-亞(ya) 甲基雙丙稀酰胺共聚而成，經濟。Superdex係：是葡聚糖與(yu) 瓊脂糖共聚而成的複合凝膠，，選擇性強，分辨率*。
• 凝膠類型：葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。
• 葡聚糖凝膠：直鏈的葡聚糖分子和交聯劑3—氯1，2—環氧丙烷交聯而成。
凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來後，繼續用三倍柱床體(ti) 積的洗脫液衝(chong) 洗凝膠後，將柱下口放在小燒杯中，慢慢打開，再將上口慢慢鬆開，使凝膠全部回收至小燒杯中，備用。
G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數字既代表交聯度，也代表特水量。X數字越小，交聯度越大，網孔越小，適用於(yu) 分離低分子質量生化產(chan) 品。X數字越大，交聯度越小，網孔越大，適用於(yu) 分離高分子生化產(chan) 品。X數字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g幹膠持水2.5mL，G-100表示 1g幹膠持水10mL，依次類推。葡聚糖凝膠和生物膠多以幹粉形式保存，使用前需用水或洗脫緩衝(chong) 液充分溶賬。在室溫下讓其充分溶賬脹達到平衡，通常需要較長時間。較快的做法是將幹膠往水裏加，邊加邊攪，以防凝膠結塊，然後放到沸水浴中加熱接近100℃，幾個(ge) 小時就可以使其溶脹，還可起到除去顆粒內(nei) 部氣泡和殺菌作用。新柱裝好後，要用洗脫緩衝(chong) 液平衡，一般用3～5倍體(ti) 積的緩衝(chong) 液在恒壓下流過柱床。新裝好的柱要檢驗其均勻性－可用帶色的高分子物質如藍色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下降。也可以對光檢查，看其是否均勻或有無氣泡存在。
蛋白質的分離純化方法
凝膠用過後，有幾種保存方法：
濕態保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；
濕態保存：在水相中加防腐劑，或水洗到中性，高壓滅菌封存（或低溫存放）；
幹燥保存：水洗後濾幹，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脫水，再用乙醚洗去乙醇，幹燥（或60～80℃烘幹）後保存。加乙醇時，切忌一上來就用濃乙醇處理，以防結塊
對生物樣品來說，經常遇到的是兩(liang) 種分離形式。一種是隻將分子量極為(wei) 懸殊的兩(liang) 類物質分開，如蛋白質與(yu) 鹽類，稱作類分離或組分離。例如從(cong) 蛋白質溶液中除去無機鹽。我們(men) 知道，蛋白質的分子量都大於(yu) 5000D，而無機鹽的分子量一般在幾十到幾百之間。所以常選用Sephadex G-25凝膠作為(wei) 分離固定相，因為(wei) 它的分離範圍是1000～5000D。被分離的兩(liang) 組物質的分子量正好落在分離範圍的兩(liang) 側(ce) 。大分子組為(wei) 全排阻，而小分子組為(wei) 全滲入，其Kd值的差可達zui大值1。對於(yu) 分子量小於(yu) 5000D的肽類進行脫鹽操作則常選用Sephadex G-15凝膠。
另一類則是要將分子量相差不很大的大分子物質加以分離，如分離血清球蛋白與(yu) 白蛋白，這叫做分級分離。後者對實驗條件和操作要求都比較高。下麵以zui常用的葡聚糖凝膠類為(wei) 例，分別加以討論 。
葡聚糖凝膠離子交換劑使用方法
新購進的陽離子交換劑（如CM-Sephadex C-25）為(wei) Na型，陰離子凝膠交換劑（如DEAE-Sephadex A-25）為(wei) Cl-型，使用前要按一般離子交換劑的使用方法進行轉型處理。1g陰離子交換劑約用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min後減壓過濾，充分洗滌，再用等量0.5mol／L HCL處理，洗至中和備用。陽離子交換劑lg約用100mL 0.5mol／L HCL浸泡20min後過濾，充分洗滌，再用等量0.5mo1／L NaOH溶液處理20min，洗至中性備用。將以上處理好的葡聚糖凝膠離子交換劑，用20～30倍量與(yu) 層析時所用的同種緩衝(chong) 液浸泡（但濃度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同種酸或堿調節至所需要pH值，放置1h後，待pH值不變即可減壓過濾。
| 型號 | 分離範圍Da | 粒徑 | 建議流速cm/h |
| Sepharose 2B | 70-40,000 | 60-200 | 10 |
| Sepharose 4B | 60-20,000 | 45-165 | 11.5 |
| Sepharose 6B | 10-40,000 | 45-165 | 14 |
| Sepharose CL-2B | 70-40,000 | 25-75 | 15 |
| Sepharose CL-4B | 60-20,000 | 25-75 | 26 |
| Sepharose CL-6B | 10-40,000 | 25-75 | 30 |
| Sepharose 6 | 5-5,000 | 20-40 | 30 |
| Sepharose 12 | 1-300 | 20-40 | 30 |
| Sepharose FF 6 | 10-4,000 | 平均90 | 300 |
| Sepharose FF 4 | 60-20,000 | 平均90 | 250 |
• 根據分子所帶電荷差異電泳法、等電聚焦等。離子交換層析法（IEX）：原理：首先是根據蛋白質的帶電類型（陽離子或陰離子），然後根據其相對電荷強度進行分離。PH：陰離子交換層析：蛋白質帶負電荷，則要求PH>PI，但不能高於(yu) 介質功能基團的PK；陽離子交換層析：蛋白質帶正電荷，則要求PH<PI，但不能低於(yu) 介質功能基團的PK；緩衝(chong) 溶液：陰離子交換層析：Tris-HCl 陽離子交換層析：PB。帶電荷量少，親(qin) 和力小的先被洗脫下來，帶電荷量多，親(qin) 和力大的後被洗脫下來。陽離子交換劑 — 帶負電荷，與(yu) 陽離子交換；陰離子交換劑 — 帶正電荷，與(yu) 陰離子交換。
常見問題分析：
不吸附：緩衝(chong) 溶液PH不對；離子強度太高；
峰形不穩或出現奇異峰：柱床中有氣泡或緩衝(chong) 溶液不純
分辨率低：梯度太大；流速太高
前沿峰：柱過載；填充效果差；柱需再生
峰拖尾：樣品在柱濾膜上或凝膠床頂部沉澱
基線隨梯度上移：鹽濃度臨(lin) 近CMC
1.離子交換樹脂
2.離子交換纖維素
§ 陰離子交換纖維素 —如:DEAE-纖維素 pH8.6以下分離中性或酸性物質,具二乙胺乙基
§ 陽離子交換纖維素—如:CM-纖維素 一般pH>4條件下使用,具有羧甲基
3.離子交換凝膠— 分離大分子物質
離子交換劑的選擇考慮因素：
1.被分離物質帶何種電荷
2.被分離物質分子的大小
大分子物質選用凝膠，其次選用纖維素
3.被分離物質所處的環境
4.被分離物質的物理化學性質
5.被分離物質的大概數量
根據疏水性不同：疏水層析（HIC）、反相色譜（RPC）： 原理：是指固定相的極性低於(yu) 流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子遷移速度快而先被洗脫下來。一般使用甲醇、乙腈作流動相，使得蛋白質容易變性失活；常用於(yu) HPLC分析，與(yu) 在水-有機相中穩定的多肽和低分子量蛋白質的分離。
蛋白質的分離純化方法
梯度淋洗裝置
外梯度:利用兩(liang) 台高壓輸液泵，將兩(liang) 種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合後進入色譜柱。
內(nei) 梯度:一台高壓泵, 通過比例調節閥,將兩(liang) 種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。
示差折光檢測器：可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與(yu) 濃度呈正比；可連續檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數差值。差值與(yu) 濃度呈正比；
親(qin) 和層析（AC）：
色譜技術
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