胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，對其在過程中的分離、純化技術展開綜述。其中，分離技術主要介紹了：鹽析法、有機溶劑沉澱法、底物親(qin) 和法、透析法。純化技術主要介紹了：凝膠過濾法、透析離子交換法。綜合比較各分離純化方法的特點，得到*的分離純化方法有機溶劑與(yu) 鹽析共沉澱法、膜分離技術、等電點沉澱法與(yu) 底物親(qin) 和法。

關(guan) 鍵詞：胃蛋白酶 分離 純化  應用 

．生物提取法胃蛋白酶

1．1 工藝路線 

          （自溶、過濾）       （脫脂、去雜質）

豬胃黏膜→自溶液→上清液

（濃縮、幹燥）

→胃蛋白酶成品

1.2工藝過程

（1）原材料的選擇和預處理：胃蛋白酶原主要存在於(yu) 胃粘膜基底部，采集原料時剝取的粘膜直徑大小與(yu) 收率有關(guan) 。一般取直徑10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜zui適宜，每頭豬胃平均剝取粘膜100g左右。（2）自溶、過濾：在夾套鍋內(nei) 預先加水100升及鹽酸3.6-4升，加熱至50度時，在攪拌下加入200千克豬胃黏膜，快速攪拌使酸度均勻，保持45—48度，消化3-4小時，得自溶液。用紗布過濾除去未消化的組織尿蛋白，收集濾液。（3）脫脂、去雜質：將濾液降溫至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，攪勻後轉入沉澱脫脂器內(nei) ，靜置24-48小時，使雜質沉澱，分出棄去，得脫脂酶液。（4）濃縮、幹燥：取清酶液，在40℃以下減壓濃縮至原體(ti) 積的1／4左右，再將濃縮液真空幹燥。球磨過80-100目篩，即得胃蛋白酶粉。

2胃蛋白酶的分離技術

2.1有機溶劑法

可用於(yu) 胃蛋白酶的初步提取濃縮。通常使用的有機溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、異丙酮，其沉澱蛋白質的能力為(wei) ：丙酮＞異丙酮＞乙醇＞甲醇。當然此順序也不是一成不變的，因為(wei) 還要受溫度、pH、離子強度等因素的影響。丙酮沉澱能力，但揮發損失多，價(jia) 格較昂貴，所以工業(ye) 上常采用乙醇作為(wei) 沉澱劑。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

2．2鹽析法

鹽析法是酶製劑工業(ye) 中常用方法之一，硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉是常用的鹽析劑，其中用的zui多的是硫酸銨。美國（2，701,228）改進後，用鋅鹽沉澱胃酶。當母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2時幾乎全部胃酶可以用醋酸鋅沉澱，沉澱物為(wei) 胃酶的鋅鹽，然後用金屬螯合劑除去鋅鹽，得15000—16000倍活力的酶，收集率為(wei) 5.0%--5.5%。此法較上述有機溶劑沉澱所得的胃酶活力和得率都高。

2.3底物親(qin) 和法

底物親(qin) 和法是利用酶（胃蛋白酶）與(yu) 其底物（酪蛋白）的親(qin) 和性，從(cong) 胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸緩衝(chong) 液中充分結合，然後調pH至4（底物的等電點）沉澱底物和酶的結合物，隨後讓沉澱物再溶解於(yu) 乳酸緩衝(chong) 液中，添加低濃度的SDS將底物和酶分離，得到酶—SDS複合物，再進一步分離純化。陳躬瑞（2001）成功的應用此法對蛇胃蛋白酶進行了實驗室分離，得率大約為(wei) 30%。與(yu) 傳(chuan) 統的分離方法比較，此法具有簡單的優(you) 點，為(wei) 後續的純化工藝避免了昂貴的活化試劑和配基的使用，同時具有較高的特異性。【2】

2.4透析法

胃蛋白酶的分離過程中還經常用到透析法。該法是利用蛋白質大分子對半透膜的不可透過性而與(yu) 小分子物質及鹽分開的。由於(yu) 透析主要是擴散過程，如果袋內(nei) 外的鹽濃度相等，擴散就會(hui) 停止，因此要經常換溶劑，一般一天換2—3次。如在冷處透析，則溶劑也要預先冷卻，避免樣品變性。透析時的鹽是否除淨，可用化學試劑或電導儀(yi) 來檢測。【1】

3胃蛋白酶的純化技術

3.1凝膠過濾法

美國在20世紀60年代研究結晶為(wei) 蛋白酶的 工藝時，是將75mg的胃蛋白酶原樣本溶解在8mL的蒸餾水中（pH5．0～6．0），在14℃±1。，pH2．0下，保持20min激活。然後用磺乙基Spandex G-25層析，zui後用羥基磷灰石進行色譜層析。結果表明用層析法得到的胃蛋白酶為(wei) 單一物質純品。

3.2離子交換層析法

陳躬瑞等人在純化蘄蛇胃蛋白酶時將SDS沉澱後的上清液上樣到預先用0．05mol／L乙酸緩衝(chong) 液（pH5．0）平衡的DEAE—TOYOPEARL離子交換色譜柱（4．6mm X 100mm）上，用0～O．25mo1／L氯化鈉梯度洗脫，流速為(wei) 1ml／min。得到的酶在5O℃30min有較高的活性，有望應用於(yu) 高溫食品加工中 。【2】

基於(yu) 以上對胃蛋白酶的分離純化技術的比較分析可以看出，長期以來分離提取技術一直沒有取得較大的突破，用有機溶劑、鹽析等技術得到的天然胃蛋白酶產(chan) 品，純度、生物活性愈將不能滿足醫藥品和工業(ye) 日益增長的需要。隨著分離科學技術的不斷發展，采用新型分離技術分離胃蛋白酶已勢在必行。因此，大多數學者認為(wei) 以下幾種技術是胃蛋白酶分離純化的方向。

胃蛋白酶提取法中分離純化技術的研究進展

3.2．1有機溶劑與(yu) 鹽析共沉澱

有機溶劑和鹽析法都是分離純化胃蛋白酶的傳(chuan) 統方法，有其各自的特點。如果將有機溶劑和鹽析配合使用，不僅(jin) 可以降低鹽的用量，而且可以不同程度的消除各自分離純化所帶來的問題，得到的胃蛋白酶純度和活性也會(hui) 有所增加。

3.2.2膜分離技術

分離膜是一種特殊的、具有選擇性透過功能的薄層物質，能利用分子大小實現分離，從(cong) 而起到濃縮和分離純化的作用。由於(yu) 其可在維持原生物體(ti) 係環境的條件下實現分離，並可地濃縮、富集產(chan) 物，有效地去除雜質，加之操作簡單，結構緊湊、能耗低，過程簡化，無一次汙染，也將成為(wei) 胃蛋白酶分離純化工藝的研究方向。

3.2.3等電點沉澱法與(yu) 底物親(qin) 和法

胃蛋白酶具有極低的等電點（如豬胃蛋白pH1．0），但胃蛋白酶的分離純化技術中等電點沉澱法未見報道，如果此方法可實現，那將大大縮短分離純化的時間。底物親(qin) 和法是分離純化胃蛋白酶的新亮點，但其工藝條件還不成熟，尤其是在分離底物和酶的複合物時，SDS的添加量有待研究。

4 結論

有人預言，21世紀將是生物技術的世紀，尤其是生物製藥技術的世紀。生物製藥被譽為(wei) 21世紀的“朝陽產(chan) 業(ye) ”。得益於(yu) 生物製藥技術的酶類藥物也日趨成熟。的胃蛋白酶分離純化工藝、技術和設備的出現，人們(men) 必將開發出的胃蛋白酶提取工藝。這對於(yu) 提高功能性胃蛋白酶產(chan) 品、提高率、降低成本和改善人民生活水平起著舉(ju) 足輕重的作用。而胃蛋白酶單一組分的製備分離，可為(wei) 胃蛋白酶的研究開發提供標準品，同時能為(wei) 後期胃蛋白酶單一組分生理活性的研究提供必要的物質保障。