蛋白質免疫印跡（Western Blot ）
蛋白質免疫印跡（Western Blot ）可以：（1）從(cong) 蛋白質混合物中檢出目標蛋白質；（2）定量或定性確定細胞或組織中蛋白質的表達情況；（3）用於(yu) 蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用後續分析。
實驗方法原理 Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質轉移到膜上，然後利用抗體(ti) 進行檢測的方法。對已知表達蛋白，可用相應抗體(ti) 作為(wei) 一抗進行檢測，對新基因的表達產(chan) 物，可通過融合部分的抗體(ti) 檢測。與(yu) Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體(ti) ，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(ti) （例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體(ti) 以非共價(jia) 鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體(ti) 上的蛋白質或多肽作為(wei) 抗原，與(yu) 對應的抗體(ti) 起免疫反應，再與(yu) 酶或同位素標記的第二抗體(ti) 起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於(yu) 檢測蛋白水平的表達。

實驗材料            蛋白質樣品
試劑、試劑盒     丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巰基乙醇 ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考馬斯亮蘭(lan) 乙酸 脫脂奶粉 硫酸鎳胺 H2O2 DAB試劑盒
儀(yi) 器、耗材          電泳儀(yi) 電泳槽 離心機 離心管 硝酸纖維素膜 勻漿器 剪刀 移液槍 刮棒
實驗步驟
一、試劑準備

1. SDS-PAGE試劑：見聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗。

2. 勻漿緩衝(chong) 液：1.0 M Tris-HCl（pH 6.8） 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 轉膜緩衝(chong) 液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS（pH7.4）：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

5. 膜染色液：考馬斯亮蘭(lan) 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現配）：脫脂奶粉1.0 g 溶於(yu) 20 ml的0.01 M PBS中。

6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。

二、蛋白樣品製備

1. 單層貼壁細胞總蛋白的提取

（1） 倒掉培養(yang) 液，並將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸幹培養(yang) 液（或將瓶直立放置一會(hui) 兒(er) 使殘餘(yu) 培養(yang) 液流到瓶底然後再用移液器將其吸走）。

（2） 每瓶細胞加3 ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然後棄去洗液。重複以上操作兩(liang) 次，共洗細胞三次以洗去培養(yang) 液。將PBS棄淨後把培養(yang) 瓶置於(yu) 冰上。

（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置於(yu) 冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與(yu) 裂解液混合。）

（4） 每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，於(yu) 冰上裂解30 min，為(wei) 使細胞充分裂解培養(yang) 瓶要經常來回搖動。

（5）裂解完後，用幹淨的刮棒將細胞刮於(yu) 培養(yang) 瓶的一側(ce) （動作要快），然後用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個(ge) 操作盡量在冰上進行。）

（6）於(yu) 4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機預冷）

（7） 將離心後的上清分裝轉移倒0.5 ml的離心管中放於(yu) －20℃保存。

2. 組織中總蛋白的提取

（1）將少量組織塊置於(yu) 1～2 ml勻漿器中球狀部位，用幹淨的剪刀將組織塊盡量剪碎。

（2） 加400 μL單去汙劑裂解液裂（含PMSF）於(yu) 勻漿器中，進行勻漿。然後置於(yu) 冰上。

（3）幾分鍾後再碾一會(hui) 兒(er) 再置於(yu) 冰上，要重複碾幾次使組織盡量碾碎。

（4） 裂解30 min後，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然後在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝於(yu) 0.5 ml離心管中並置於(yu) －20℃保存。

3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取

由於(yu) 受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按1操作外還應收集培養(yang) 液中的細胞。以下是培養(yang) 液中細胞總蛋白的提取：

（1）將培養(yang) 液倒至15 ml離心管中，於(yu) 2500 rpm離心5 min。

（2）棄上清，加入4 ml PBS並用槍輕輕吹打洗滌，然後2500 rpm離心5 min。棄上清後用PBS重複洗滌一次。

（3）用槍洗幹上清後，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。

（4）將裂解液與(yu) 培養(yang) 瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝於(yu) 0.5 ml離心管中並置於(yu) －20℃保存。

三、 蛋白含量的測定

1. 製作標準曲線

（1）從(cong) －20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化後，備用。

（2）取18個(ge) 1.5 ml離心管，3個(ge) 一組，分別標記為(wei) 0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。

（3）按下表在各管中加入各種試劑。

（4） 混勻後，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。

2. 檢測樣品蛋白含量

（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲(chu) 存的考馬斯亮藍溶液1 ml。室溫放置30 min後即可用於(yu) 測蛋白。

（2） 取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鍾可做為(wei) 空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。

（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。

（4）取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻後靜置2 min，倒入扣幹的比色杯中按sample鍵測樣品。

注意：每測一個(ge) 樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個(ge) 樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5 ml樣品含的蛋白量。

四、SDS－PAGE電泳

1. 清洗玻璃板

一隻手扣緊玻璃板，另一隻手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩(liang) 麵都擦洗過後用自來水衝(chong) ，再用蒸餾水衝(chong) 洗幹淨後立在筐裏晾幹。

2. 灌膠與(yu) 上樣

（1）玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩(liang) 玻璃對齊，以免漏膠。）

（2）按前麵方法配10%分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠麵升到綠帶中間線高度時即可。然後膠上加一層水，液封後的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠麵快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會(hui) 有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會(hui) 被衝(chong) 變型。）

（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水並用吸水紙將水吸幹。

（4）按前麵方法配4%的濃縮膠,加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘(yu) 空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chan) 生。插梳子時要使梳子保持水平。由於(yu) 膠凝固時體(ti) 積會(hui) 收縮減小，從(cong) 而使加樣孔的上樣體(ti) 積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩(liang) 邊補膠。待到濃縮膠凝固後，兩(liang) 手分別捏住梳子的兩(liang) 邊豎直向上輕輕將其拔出。

（5）用水衝(chong) 洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板麵向內(nei) ，大玻璃板麵向外。若隻跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一麵麵向外。）

（6）測完蛋白含量後，計算含50 ng蛋白的溶液體(ti) 積即為(wei) 上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩衝(chong) 液至終濃度為(wei) 1×。（上樣總體(ti) 積一般不超過15 μl，加樣孔的zui大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品於(yu) 沸水中煮5 min使蛋白變性。

（7） 加足夠的電泳液後開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內(nei) 測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品衝(chong) 出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個(ge) 樣品時，進樣器需在外槽電泳緩衝(chong) 液中洗滌3次，以免交叉汙染。

3. 電泳

電泳時間一般4～5 h，電壓為(wei) 40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭(lan) 剛跑出即可終止電泳，進行轉膜。

五、轉膜

1. 轉一張膜需準備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為(wei) 手上的蛋白會(hui) 汙染膜。將切好的硝酸纖維素膜置於(yu) 水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置於(yu) 有超純水的平皿裏，要使膜浮於(yu) 水上，隻有下層才與(yu) 水接觸。這樣由於(yu) 毛細管作用可使整個(ge) 膜浸濕。若膜沉入水裏，膜與(yu) 水之間形成一層空氣膜，這樣會(hui) 阻止膜吸水。

2. 在加有轉移液的搪瓷盤裏放入轉膜用的夾子、兩(liang) 塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。

3. 將夾子打開使黑的一麵保持水平。在上麵墊一張海綿墊，用玻棒來回擀幾遍以擀走裏麵的氣泡。（一手擀另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊於(yu) 墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。

4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩(liang) 個(ge) 邊上輕輕的反複撬。撬一會(hui) 兒(er) 玻璃板便開始鬆動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板後，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋於(yu) 濾紙上，用手調整使其與(yu) 濾紙對齊，輕輕用玻棒擀去氣泡。將膜蓋於(yu) 膠上，要蓋滿整個(ge) 膠（膜蓋下後不可再移動）並除氣泡。在膜上蓋3張濾紙並除去氣泡。zui後蓋上另一個(ge) 海綿墊，擀幾下就可合起夾子。整個(ge) 操作在轉移液中進行，要不斷的擀去氣泡。膜兩(liang) 邊的濾紙不能相互接觸，接觸後會(hui) 發生短路。（轉移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。）

5. 將夾子放入轉移槽槽中，要使夾的黑麵對槽的黑麵，夾的白麵對槽的紅麵。電轉移時會(hui) 產(chan) 熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉移2 h或40 V轉移3 h。

6. 轉完後將膜用1×麗(li) 春紅染液染5 min（於(yu) 脫色搖床上搖）。然後用水衝(chong) 洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾幹備用。

六、免疫反應

1 . 將膜用TBS從(cong) 下向上浸濕後，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。

2. 將一抗用TBST稀釋至適當濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當大小的一塊兒(er) 保鮮膜鋪於(yu) 實驗台麵上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體(ti) 溶液加到保鮮膜上；從(cong) 封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液後，將膜蛋白麵朝下放於(yu) 抗體(ti) 液麵上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩(liang) 次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。

3. 同上方法準備二抗稀釋液並與(yu) 膜接觸，室溫下孵育1～2 h後，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩(liang) 次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進行化學發光反應。

七、化學發光，顯影，定影

1. 將A和B兩(liang) 種試劑在保鮮膜上等體(ti) 積混合；1 min後，將膜蛋白麵朝下與(yu) 此混合液充分接觸；1 min後，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。

2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當大小（比膜的長和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guan) 上X-光片夾，開始計時；根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為(wei) 1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達*效果；曝光完成後，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現明顯條帶後，即刻終止顯影。顯影時間一般為(wei) 1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低於(yu) 16℃）需適當延長顯影時間；顯影結束後，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為(wei) 5～10 min，以膠片透明為(wei) 止；用自來水衝(chong) 去殘留的定影液後，室溫下晾幹。

應注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷(shang) 膠片，否則會(hui) 對結果產(chan) 生影響。

八、凝膠圖象分析

將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理係統分析目標帶的分子量和淨光密度值