細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
細胞凋亡的細胞化學測定

細胞凋亡的細胞化學測定包括細胞表麵（細胞膜）的結構和通透性改變的測定和細胞核DNA改變的測定。根據應用的範圍，又可分為(wei) 細胞群休和單個(ge) 細胞測定兩(liang) 種，以下僅(jin) 介紹其中幾種較為(wei) 常用的方法。

碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測

早期死亡細胞膜通透性狀態的不同是區分細胞凋亡和壞死的一個(ge) 重要指標，凋亡細胞在進入zui終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質量大的與(yu) DNA結合的熒光染料（如PI）不能時入凋亡細胞內(nei) ，而相對分子質量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀(yi) 或熒光顯微鏡可區分和壞死細胞，細胞內(nei) DNA出現Hoechest 3342標記而不出現PI標記的為(wei) 凋亡細胞。

細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
檢測方法：獲取11×106細胞/ml的細胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進行流式細胞儀(yi) 分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發，前者熒光為(wei) 紅色（620nm）,後者熒光為(wei) 藍色（480nm）。正常細胞藍色zui強。早期凋亡細胞由於(yu) DNA的漏出藍色稍弱並有少量的紅色熒光，晚期凋亡細胞紅色熒光加強。壞死細胞紅色熒光zui強。

膜聯蛋白（annexin）V標記

正常細胞的細胞膜磷脂分布是不對稱的，磷脂酰絲(si) 氨酸（phosphatidylserine,PS）位於(yu) 細胞膜內(nei) 側(ce) ，在細胞凋亡時轉至細胞膜外表麵，這一改變被認為(wei) 是特導性的，並且可作為(wei) 凋亡細胞表麵改變的標記。PS表麵化發生於(yu) 凋早期，其機製尚不清，可能是一種導致機體(ti) 吞噬凋亡細胞的信號。膜聯蛋白V是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，對PS具有高度親(qin) 和力，熒光標記的膜聯蛋白V與(yu) 細胞表現PS結合，再用顯微鏡或流式細胞儀(yi) 進行檢測，可以觀察凋亡過程中細胞膜PS的表麵化。結合PI染色進行雙參數檢測尚能區分正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞及壞死細胞。正常細胞膜聯蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細胞膜聯蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細胞和壞死細胞膜聯蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯蛋白V標記僅(jin) 有不到三分之一的凋亡細胞出現陽性標記，其原因尚不明。同時需注意度的是凋亡後期溶解階段，細胞碎片也可出現明顯的陽性著色。

檢測方法：1×106細胞/ml細胞懸液，先後用膜聯蛋白V--FITC及PI染色，流式細胞儀(yi) 分析，獲得由四個(ge) 象限組成的細胞直方圖（cytogram），每個(ge) 象限的細胞數目就是在檢測細胞總數在所點的組份。左下象限代表正常細胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細胞和壞死細胞（An+PI+）,左上象限代表細胞收集過程中出現的損傷(shang) 細胞（An-PI+）。用生物素標記膜聯蛋白V還可以作體(ti) 內(nei) 試驗。將生物素標記膜聯蛋白V注射小鼠體(ti) 內(nei) ，30分鍾後處死，迅速取出要研究的組織置於(yu) 甲醛內(nei) 固定，然後，常規石蠟切片，脫蠟、水化，用親(qin) 和素標記的過氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細胞。

DNA瓊脂凝膠電泳法

細胞凋亡時，在內(nei) 源性核酸內(nei) 切酶的作用下，DNA在核小體(ti) 間被切割成180-200bp整數倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時表現為(wei) 特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內(nei) 源性核酸內(nei) 切酶降解產(chan) 生“梯形帶”與(yu) 細胞凋亡相以來，“梯形帶”被作為(wei) 細胞凋亡的一個(ge) 重要的生化指標。盡管有報道指出，實驗中出現典型的形態改變時可不伴有核小體(ti) 間的DNA降解，對這一指標提出質疑，本方法仍被廣泛應用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細胞同時存在時才出現典型的結果，且隻能被用於(yu) 細胞群體(ti) ，不能用於(yu) 組織的原位檢測。

檢測方法：培養(yang) 細胞清洗、離心，加入細胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然後加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進行電泳，zui後在紫外線燈下觀察和攝影。

DNA裂解的原位檢測

在細胞水平檢測DNA裂解的原位標記技術已越來越多地被用於(yu) 組織切片和培養(yang) 細胞，細胞凋亡時，由於(yu) DNA的裂解，形成單或寡核小體(ti) 的雙鏈相對分子質量小的片段及在相對分子質量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類斷裂可用生物素、地高辛或熒光素標記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉移酶（TdT），前者使核苷酸結合於(yu) 缺口，需要模板存在，標記方法通常被稱為(wei) “原位缺口平移”（insitu nick translation,ISNT）,後者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱為(wei) 未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應用已很廣泛，其優(you) 點是可用於(yu) 原位標記，可用於(yu) 病理組織，並可進行定量分析。值得注意的是壞死期由於(yu) 內(nei) 源性核酸內(nei) 切酶和蛋白質酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現 陽性反應。組織或細胞外理不當時可出現假陽性。因而，TUNEL等方法對凋亡細胞的標記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標記的分析應結合陽性細胞的形態，尤其是核的特征，細胞的分布和有無炎症反應，除外非凋亡的陽性反應。

檢測方法：石蠟切片常規脫蠟、水化，蛋白質酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過氧化物酶標記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標可用NBT+BCIP顯色），複染，脫水，封片。凋亡細胞核呈現藍色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。

凋亡蛋白質酶（Caspase）-3及其底物的檢測

凋亡蛋白質酶是一類半胱氨酸蛋白質酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調亡研究的深入而發現的重要凋亡分子。迄今已有13個(ge) 分子得到命名，分別為(wei) 凋亡蛋白質酶1-13。基中凋亡蛋白質-3是被認為(wei) 在多種組織、細胞類型中zui常涉及的凋亡效應分子。活化的凋亡蛋白質酶-3僅(jin) 在凋亡細胞中發現，因此，檢測凋亡蛋白質酶-3的活性有助於(yu) 發現早期的凋亡細胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質酶-3在D與(yu) AMC之間水解，釋放熒光物質、AMC，後者在紫外線激發下發出波長為(wei) 430-460nm的熒光，通過流式細胞儀(yi) 或分光光度計對其強度進行定量，從(cong) 而測定凋亡蛋白質酶-3的活性。由於(yu) 醛對凋亡蛋白質酶-3的水解活性抑製作用，因此同時加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑製凋亡蛋白質酶-3對DEVD-AMC的水解，不產(chan) 生熒光。這樣的抑製試驗可作為(wei) 對照，使凋亡蛋白質酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用於(yu) 組隻切片，因此有人嚐試采用針對活化的凋亡蛋白質酶-3亞(ya) 基的抗體(ti) ，通過免疫組化顯示凋亡細胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿意。

檢測方法：培養(yang) 細胞（也可以預先作凋亡誘導並在不同時段收集細胞）在裂解液內(nei) 裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時用不加底物的樣品作對照，流式細胞儀(yi) 檢測，加有底物的樣品釋放出的熒光強度樣對照樣品明顯增強。如加入DEVD-AMC時再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強度與(yu) 對照樣品無差異。

細胞凋亡檢測方法在腫瘤研究中的應用
凋亡蛋白質酶-3導致細胞凋良心是通過水解或滅活一些細胞關(guan) 鍵蛋白質實現的，因此檢測凋亡蛋白質酶-3底物的改變也有助於(yu) 辨認細胞的凋亡。PARP是*個(ge) 被認識的凋亡蛋白質酶-3底物，它的相對分子質量為(wei) 116000，水解後形成相對分子質量為(wei) 85000及相對分子質量為(wei) 25000的兩(liang) 個(ge) 片段，用運載相對分子質量為(wei) 85000片段的抗體(ti) 可以觀察細胞是否發生凋亡。細胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質酶-3水解後，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個(ge) 新的抗原表位，用抗此表位的抗體(ti) 可以在組織切片上辨認凋亡細胞。另外一種細胞骨架蛋白質肌動蛋白（actin）被水解後產(chan) 生一種稱為(wei) “fractin”的片段，在凋亡早期出現，並認為(wei) 與(yu) 細胞膜的起泡有關(guan) ，可能有助於(yu) 早期凋亡細胞的辨認。總之，隨著對凋亡蛋白質酶及其底物的進一步研究，將會(hui) 發現更有價(jia) 值的有助於(yu) 檢測凋亡細胞的方法。