【摘要】：免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體(ti) 分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應係統中抗原或抗體(ti) 的性質與(yu) 含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為(wei) 3大免疫標記技術。
相關(guan) 專(zhuan) 題ELISA免疫實驗技術
免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體(ti) 分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應係統中抗原或抗體(ti) 的性質與(yu) 含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為(wei) 3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發光物質、鐵蛋白和膠體(ti) 金等。
1.原理
辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)
辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從(cong) 辣根中分離此酶，以後又製備出結晶。本實驗是以辣根為(wei) 原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冰凍幹燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶是一種含亞(ya) 鐵血紅素的蛋白質，HRP廣泛分布於(yu) 植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(ge) 同功酶組成，Mr在40000左右，等電點7.2。溶於(yu) 水，溶解度為(wei) 5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體(ti) 不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶於(yu) 水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶於(yu) 0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創木酚為(wei) 氫給體(ti) 而言)。在室溫下，HRP幾周內(nei) 穩定，加熱到63℃，在15min內(nei) 穩定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為(wei) 7.71時，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為(wei) 403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b
酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體(ti) 和酶標記SPA等。酶標記物質量的好壞直接關(guan) 係到免疫酶技術的成功與(yu) 否，因此被稱為(wei) 關(guan) 鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體(ti) ，它是將酶與(yu) 特異性抗體(ti) 經適當方法連接而成。酶標記抗體(ti) 的質量主要取決(jue) 於(yu) 純度好、活性強及親(qin) 和力高的酶和抗體(ti) ，其次要有良好的製備方法。目前，高質量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nei) 已有商品供應。高質量的抗體(ti) 則可通過提取純化而獲得。在製備方法上，宜選用產(chan) 率高、不影響結合物的活性和不混雜幹擾性物質且操作簡便易行的方法。
酶製劑及其底物
凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為(wei) 標記用。但作為(wei) 標記抗體(ti) 用的酶應滿足下列要求：
(1)來源方便，易於(yu) 純化;
(2)比活性高，性質穩定;
(3)酶活性和量能
用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為(wei) 辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由於(yu) 辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易製備，所以zui常用。HRP廣泛分布於(yu) 植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(ge) 同功酶組成，分子量為(wei) 40,000,等電點為(wei) PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體(ti) 不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶於(yu) 水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為(wei) 403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度並不表示酶活性，如當酶變性後，RZ值仍可不變。
HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(ti) (DH2)。供氫體(ti) 多為(wei) 無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
HRP2 ~2 y( w9 E+ M
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氫體(ti) 的種類很多，形成的產(chan) 物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯苯胺)的反應產(chan) 物為(wei) 不溶性沉澱物，並有電子密度，故適宜於(yu) 做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用於(yu) ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控製到無色，現已很少應用。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產(chan) 生鮮豔的藍綠色產(chan) 物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由於(yu) 產(chan) 物不穩定，需要在短時間內(nei) 進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體(ti) 是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產(chan) 物為(wei) 深桔黃色或棕色，後者產(chan) 物為(wei) 藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近於(yu) 無色，靈敏度上據報道後者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體(ti) 稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯並噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產(chan) 物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方麵，ABTS與(yu) TMB皆是值得被優(you) 選的供氫體(ti) 。
由於(yu) HRP的底物H2O2本身又是酶的抑製劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控製在經較短時間反應後呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會(hui) 增加反應產(chan) 物的顏色。
酶與(yu) 抗體(ti) 交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對於(yu) 製備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法隻適用於(yu) 含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表麵的多糖氧化為(wei) 醛基，醛基與(yu) 抗體(ti) 分子上的氨基形成Schiff堿而結合。後者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體(ti) 。
2.實驗步驟
HRP的製備
1).水提取：稱取5kg用水衝(chong) 刷幹淨的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐(feng) 富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。次日用甩幹機(或離心機)甩幹，收集濾液，碎渣再用1/4倍體(ti) 積水浸泡提取1次，合並2次濾液，測得總體(ti) 積。
2).硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當於(yu) 0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內(nei) 加完。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下麵混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉澱，合並上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解後。次日，虹吸出上清液，沉澱部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉澱。將沉澱懸浮於(yu) 100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉澱全部溶解為(wei) 止)，分裝於(yu) 透析袋內(nei) ，放在流動自來水中進行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為(wei) 止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然後改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為(wei) 止。將透析液合並，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min，棄去沉澱，量上清液的體(ti) 積。
3).丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯並置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體(ti) 積預冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉澱。上清液再加入0.8體(ti) 積(按原上清液體(ti) 積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置後，在冰凍離心機中離心收集沉澱。將沉澱溶於(yu) 少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近於(yu) 1的酶溶液。
4).精製：將上步酶液適當稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為(wei) 10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉澱用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與(yu) 清液合並，分裝於(yu) 透析袋內(nei) ，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冰凍幹燥(約得20mg)，產(chan) 品呈米黃色纖維狀鬆軟物，HRP產(chan) 品的RZ值可達3.0左右，置真空幹燥器中低溫保存。
(1)戊二醛二步法) 
1) 原理：戊二醛為(wei) 一種雙功能試劑，通過其醛基分別與(yu) 酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jia) 結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2)標記步驟：
(1) 稱取HRP25mg溶於(yu) 1.25%戊二醛溶液中。
(2) 反應後的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控製在1ml/1分鍾，收集棕色流出液。如體(ti) 積大於(yu) 5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3) 將待標記的抗體(ti) 12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩衝(chong) 液0.25ml，繼續攪拌3?小時。) 
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻後，置室溫2小時。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體(ti) 積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉澱物用半飽和硫酸銨洗二次，zui後沉澱物溶於(yu) 少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩衝(chong) 鹽水透析，去除銨離子後(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鍾去除沉澱，上清液即為(wei) 酶結合物，分裝後，冰凍保存。
3)結果判定：
(1) 定性及效價(jia) 滴定：用特異性抗原(或抗體(ti) )同酶標記抗體(ti) (或抗免疫球蛋白抗體(ti) )作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然後用酶的底物使沉澱弧顯色，可初步鑒定其活性。zui後以直接ELISA法(或在正式實驗係統裏)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.48 
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 49 
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標記步驟比較簡單，重複性好。缺點是酶的利用率低，一般隻有2~4%的酶與(yu) 蛋白質結合。
4)試劑及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩衝(chong) 鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與(yu) PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩衝(chong) 液：取1M碳酸鈉3ml與(yu) 1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶於(yu) 0.01M PH9.5碳酸緩衝(chong) 液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體(ti) 或抗Ig抗體(ti) 。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計，離心機。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
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(2)簡易過碘酸鈉法% E0 O+ v: s2 T
本法是以NaIO4先將HRP表麵的糖分子氧化成醛基，然後再與(yu) Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體(ti) 的產(chan) 率高，將近70%的HRP和Ig結合，99%的Ig與(yu) 酶結合，酶與(yu) Ig的活性無重大損失，是目前zui常用的方法。
1)原理：
經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。後來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從(cong) 而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化後形成的醛化酶可與(yu) 抗體(ti) 分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，後者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體(ti) 。
8 n% @9 _& U8 s6 V2)標記步驟:
(1) 稱取5mgHRP溶解於(yu) 1ml蒸餾水中。
(2) 於(yu) 上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鍾。
(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩衝(chong) 液透析。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝(chong) 液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5，然後立即加入10mg IgG(抗體(ti) ，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩衝(chong) 液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。
(6) 將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析。
其餘(yu) 步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。
3)結果判定：
除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其餘(yu) 均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4)試劑及器材:
(1) 0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶於(yu) 蒸餾水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩衝(chong) 液
0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩衝(chong) 液:3 ?! $ z* p7 ]" g& X. E) z( f
Na2CO3 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {
NaHCO3 0.586克: H% E M! O w- M
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩衝(chong) 液。
(4) NaBH4溶液(4mg/ml):
臨(lin) 用時稱取NaBH44mg溶於(yu) 1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。
3.工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為(wei) 酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產(chan) 生很大的波動。另外，由於(yu) 濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體(ti) 的滴定方法是：將抗原(或抗體(ti) )物理吸附於(yu) 固相載體(ti) 上，然後將經過一係列稀釋的酶標抗體(ti) (或抗Ig抗體(ti) )與(yu) 吸附在載體(ti) 上的抗原(或抗體(ti) )起反應，以酶與(yu) 底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體(ti) 的效價(jia) ，或稱工作濃度。
其步驟為(wei) ：先將抗原(或抗體(ti) )用0.05M PH9.6包被緩衝(chong) 液稀釋為(wei) 10μg/ml左右，於(yu) 聚苯乙烯板孔內(nei) 加0.1ml，次日以洗滌緩衝(chong) 液洗滌3次。酶標記抗體(ti) 用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體(ti) 的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個(ge) 稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時後洗滌。然後加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鍾。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
結果判定主要以ELISA比色儀(yi) 讀取各孔OD值。並以OD為(wei) 縱座標，結合物濃度為(wei) 橫座標，繪製滴定曲線。由曲線上查得OD值為(wei) 1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標抗體(ti) 稀釋度，即為(wei) 該標記物的工作濃度。
有關(guan) 試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
C要說明的是，本法為(wei) ELISA直接法，所測的工作濃度與(yu) 在實際應用中的zui適濃度可相差幾個(ge) 滴度。這就要求在建立ELISA實驗係統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到zui適的實驗條件。
4.注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體(ti) 也要活性高,效價(jia) 高(zui低1∶16),純度高，親(qin) 和力好，這是保證標記物效價(jia) 高，免疫活性好的首要條件。"
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴(yan) 格掌握。所用試劑，(或必需)新鮮配製。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為(wei) 新鮮純品，因戊二醛儲(chu) 存過久可形成縮和體(ti) (雜質)。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內(nei) 溫度一般在25℃為(wei) 宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩定，常加入30～40%甘油於(yu) -10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，隻能保存數周。已配製的使用液應在12小時內(nei) 用完。切忌反複凍融。