研生試劑-熒光素FITC標記抗體(ti) 的方法

常用Marsshall(1958)法標記熒光抗體(ti) ，也可以根據條件采用Chadwick等標記法或Clark等(1963)的透析標記法。

    1．Marsshall法

    (1)材料    抗體(ti) 球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩衝(chong) 液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光

素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或

3．0的0．01mol／LPBS等。

    (2)方法及步驟    ①抗體(ti) 的準備  取適量已知濃度的球蛋白溶液於(yu) 燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩衝(chong) 液，使zui後免疫球蛋白濃度為(wei) 20mg／ml，碳酸鹽緩衝(chong) 液容量為(wei) 總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為(wei) 宜)5～10min。

    ②熒光素的準備  根據欲標記的蛋白質總量，按每毫克免疫球蛋白加0．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩衝(chong) 液的量。

    a．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。

    b．總蛋白量(AXB)＝Crag。

    c．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低於(yu) 20mg／ml，用C／10；如高於(yu) 20mg／ml，用C／20)。

    d．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg。

    e．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩衝(chong) 液D／10＝Fml。

    f． PBS量D-(B+F)=Gml。

    注：A為(wei) 蛋白含量，mg／ml；B為(wei) 蛋白質溶液的容積；C為(wei) 蛋白總量，mg；D為(wei) 常數，mg；正為(wei) 熒光素的量，mg；F為(wei) 碳酸鹽緩衝(chong) 液的容積，ml；G為(wei) PBS的容積，ml。

    ③結合(或標記)  邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘於(yu) 燒瓶壁(大約在5—10min內(nei) 加完)，加完後，繼續避光攪拌12h左右。結合期間應保持蛋白溶液於(yu) 4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。

    ④透析  結合完畢後，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉澱物，裝入透析袋中，再置於(yu) 燒杯中，用pH8．0緩衝(chong) 鹽水透析(0～4~C)。

    ⑤過柱  取透析的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離遊離熒光素，收集標記的熒光抗體(ti) 進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩衝(chong) 液(pH7．2)；過濾量：12ml標記蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)。

    2．Chadwick法

    (1)試劑和材料    抗體(ti) 球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/L pH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等。

    (2)方法及步驟    ①抗體(ti) 準備  用o～4~C的pH8。0磷酸鹽緩衝(chong) 鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為(wei) 30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nei) ，放於(yu) 冰槽中。

    ②熒光色素準備  按每毫克免疫球蛋白加入熒光素0．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解。

    ③將準備的抗體(ti) 與(yu) 熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結合(在磁力攪拌機上持續攪拌)18～24h。

    ④透析和柱層析  方法同Marsshall法。

    3．改良法

    (1)試劑和材料    ①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi 18g、Na2HP04 1．15g，溶於(yu) 2000ml蒸餾水

    ②0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩衝(chong) 液配法  取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合後，校定pH至9．0。

    ③3％碳酸鈉水溶液配法  稱L 5g無水碳酸鈉充分溶解於(yu) 50ml滅菌蒸餾水中即成。

    ④其他試劑和材料  l％*、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等。

    (2)方法及步驟    ①取價(jia) 的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩衝(chong) 液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nei) 含蛋白質lOmg，緩衝(chong) 液為(wei) 總量的10％，降溫至4℃。

    ②加入異硫氰酸鹽(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4~C

下電磁攪拌12～14h。

    ③然後用半飽和的硫酸銨將標記球蛋白沉澱分離，除去未結合的熒光素，再用緩衝(chong) 鹽水透析，除去硫酸銨(用Nessler試劑測驗，至隔夜透析的鹽水無氨離子及熒光色素為(wei) 止)。

    ④將製備好的熒光抗體(ti) 加*o．01％，分裝在lml安瓿中，或凍幹，保存於(yu) 冰箱中(4℃)可以用半年以上，一20~C保存可達2年以上。

    4．透析標記法

   此法適用於(yu) 小量抗體(ti) 的熒光素標記，標記簡便，非特異性染色較少。

   (1)試劑和材料   試劑和材料同改良法。

   (2)方法及步驟   ①用0．025mol／L碳酸鹽緩衝(chong) 液pH9．0，將欲標記免疫球蛋白稀釋成1％濃度，裝入透析袋中。

   ②用同一緩衝(chong) 液將FITC配成0．1mg／ml的溶液，按10mg／ml球蛋白溶液體(ti) 積的10倍，將FITC稀釋液盛於(yu) 圓柱形容器內(nei) ，並使透析袋浸沒於(yu) FITC液中。

   ③容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4~C電磁攪拌下透析標記24h。取出透析袋中標記液，即刻用SephadexG50凝膠過濾，去除遊離熒光素，分裝，貯存於(yu) 4℃中。