細胞融合的步驟：

    1.製備飼養(yang) 細胞層  一般選擇小鼠腹腔巨噬細胞。

與(yu) 免疫小鼠相同晶係的小鼠，常用BALB／C小鼠，6～10周齡

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拉頸處死，浸泡在75％乙醇內(nei) ，3～5min

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用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

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用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養(yang) 液(嚴(yan) 禁刺破腸管)

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反複衝(chong) 洗，吸出衝(chong) 洗液

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衝(chong) 洗液放人10ml離心管，1 200r／min／分離5～6min

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用20％小牛血清或胎牛血清的培養(yang) 液混懸，調整細胞數至lXl0‘／ml

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加入96孔板，100ul/孔

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放人37℃C02孵箱培養(yang)

    2．製備免疫脾細胞  

zui後一次加強免疫3d後小鼠拉頸處死

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無菌取脾髒，培養(yang) 液洗1次

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脾髒研碎，過不鏽鋼篩網

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離心，細胞用培養(yang) 液洗2次

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計數

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取脾淋巴細胞懸液備用

    3．製備骨髓瘤細胞

般選用小鼠腹

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取對數生長期骨髓瘤細胞離心

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用無血清培養(yang) 液洗2次

4.融合

    (1)將骨髓瘤細胞與(yu) 脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50m1離心管中用無血清不*培養(yang) 液洗1次，離心，l 200r／min，8min；棄上清液，用吸管吸淨殘留液體(ti) ，以免影響聚乙二醇(PEG)濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略鬆動。

    (2)90s內(nei) 加入37℃預溫的1m1 45％PEG(分子量4 000)溶液，邊加邊輕搖。37℃水浴作用90s。

    (3)加37℃預溫的不*培養(yang) 液以終止PEG作用，每隔2min分別加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

    (4)離心，800r／rain，6min。

    (5)棄上清液，用含20％小牛血清HAT選擇培養(yang) 液重懸。

    (6)將上述細胞，加到已有飼養(yang) 細胞層的96孑L板內(nei) ，每孔加100tzl。一般1個(ge) 免疫脾髒可接種4塊96孔板。

    (7)將培養(yang) 板置37℃、5％CO：培養(yang) 箱中培養(yang) 。

    細胞融合是雜交瘤技術的中心環節，基本步驟是將兩(liang) 種細胞混合後加入PEG使細胞彼此融合。然後用培養(yang) 液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合後的細胞適當稀釋，分置培養(yang) 板孔中培養(yang) 。融合過程中有3個(ge) 問題應特別注意，①細胞比例，骨髓瘤細胞與(yu) 脾細胞的比值可從(cong) 1：2到1：10不等，常用1：4的比例。應保證兩(liang) 種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間，在兩(liang) 種細胞的混合細胞懸液中，第1分鍾滴加4。5ml培養(yang) 液；間隔2rain滴加5ml培養(yang) 液，然後加培養(yang) 液50ml。③培養(yang) 液的成分，良好的培養(yang) 液對融合細胞尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yang) 成分均需嚴(yan) 格配製。如融合效率降低，應隨時核查培養(yang) 基情況。