使用目的：本試劑盒用於(yu) 測定金魚血清、血漿及相關(guan) 液體(ti) 樣本中Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP）含量。

實驗原理
本試劑盒應用雙抗體(ti) 夾心法測定標本中水平。用純化的金魚Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP）抗體(ti) 包被微孔板，製成固相抗體(ti) ，往包被單抗的微孔中依次加入Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP），再與(yu) HRP 標記的Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP）抗體(ti) 結合，形成抗體(ti) -抗原-酶標抗體(ti) 複合物，經過*洗滌後加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中金魚Agouti 相關(guan) 蛋白（AGRP）濃度。

試劑盒組成
1 30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶
2 酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（80ng/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶
4 樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書(shu) 1 份
5 顯色劑A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張
6 顯色劑B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個(ge)

標本要求
1．標本采集後盡早進行提取，提取按相關(guan) 文獻進行，提取後應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於(yu) -20℃保存，但應避免反複凍融
2．不能檢測含NaN3 的樣品，因NaN3 抑製辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
40 ng/L 5 號標準品 150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
20 ng/L 4 號標準品 150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
10 ng/L 3 號標準品 150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
5.0 ng/L 2 號標準品 150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2.5 ng/L 1 號標準品 150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘(yu) 各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為(wei) 5 倍）。加樣將樣品加於(yu) 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30 分鍾。
4. 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋後備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體(ti) ，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒後棄去，如此重複5 次，拍幹。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同3。
8. 洗滌：操作同5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鍾.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
11.測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液後15 分鍾以內(nei) 進行。

操作程序總結：
計算
以標準物的濃度為(wei) 橫坐標，OD 值為(wei) 縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。