人內(nei) 脂素（Visfatin）試劑盒實驗操作步驟

本試劑僅(jin) 供研究使用  標本：血清或血漿

試驗原理：
試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知Visfatin濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nei) 進行檢測。先將Visfatin和生物素標記的抗體(ti) 同時溫育。洗滌後，加入親(qin) 和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然後加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產(chan) 生顏色。顏色的深淺和樣品中Visfatin的濃度呈比例關(guan) 係。

操作注意事項

1．試劑應按標簽說明書(shu) 儲(chu) 存，使用前恢複到室溫。稀稀過後的標準品應丟(diu) 棄，不可保存。
2．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4．使用一次性的吸頭以免交叉汙染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5．使用幹淨的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒裏的各種成份及樣品。
6．洗滌酶標板時應充分拍幹，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7．底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露於(yu) 光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成後應立即讀取OD值。
8．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9．按照說明書(shu) 中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
1、血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管。收集血液後，1000×g離心10分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、人內(nei) 脂素Visfatin血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於(yu) 檢測。1000×g離心30分鍾去除顆粒。
3、細胞上清液---1000×g離心10分鍾去除顆粒和聚合物。
4、組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鍾，取上清液
5、保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反複冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
1．標準品：標準品的係列稀釋應在實驗時準備，不能儲(chu) 存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
40 ng/ml    （6號標準品）    原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
20 ng/ml    （5號標準品）    100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
10 ng/ml    （4號標準品）    100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0 ng/ml    （3號標準品）    100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 ng/ml    （2號標準品）    100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
1.25 ng/ml    （1號標準品）    100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml    （空白對照）    原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩衝(chong) 液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
1．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體(ti) 產(chan) 生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chan) 生加樣上的誤差。
2．根據待測樣品數量加上標準品的數量決(jue) 定所需的板條數。每個(ge) 標準品和空白孔建議做複孔。每個(ge) 樣品根據自己的數量來定，能使用複孔的盡量做複孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋後加入50ul於(yu) 反應孔內(nei) 。
3．加入稀釋好後的標準品50ul於(yu) 反應孔、加入待測樣品50ul於(yu) 反應孔內(nei) 。立即加入50ul的生物素標記的抗體(ti) 。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4．甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5．每孔加入80ul的親(qin) 和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鍾。
6．甩去孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍幹。重複此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鍾。避免光照。
8．取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液後應立即測定結果。
9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

人內(nei) 脂素Visfatin試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小於(yu) 1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R值為(wei) 0.990。
2. 特異性：不與(yu) 其它細胞因子反應。
3. 重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 10%。

結果判斷與(yu) 分析
1、儀(yi) 器值：於(yu) 波長450nm的酶標儀(yi) 上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為(wei) 縱坐標（Y），相應的Visfatin標準品濃度為(wei) 橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的Visfatin含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
3、檢測值範圍：0-40ng/ml
4、敏感度： 0.1 ng/ml