兔蛋白激酶A（PKA）試劑盒說明書(shu)

檢測原理
試劑盒采用雙抗體(ti) 一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被蛋白激酶A（PKA）抗體(ti) 的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體(ti) ，經過溫育並*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白激酶A（PKA）呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1. 血清：使用不含熱原和內(nei) 毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液後，3000 轉離心10 分鍾將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉離心30 分鍾取上清。

3. 細胞上清液：3000 轉離心10 分鍾去除顆粒和聚合物。

4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉離心10 分鍾取上清。

5. 保存：如果樣本收集後不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存於(yu) -20℃，避免反複凍融，在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

操作注意事項

1. 兔蛋白激酶PKA試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20 分鍾。從(cong) 冰箱取出的濃縮洗滌液會(hui) 有結晶，這屬於(yu) 正常現象，水浴加熱使結晶*溶解後再使用。

2. 實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封（低溫幹燥）保存。

3. 濃度為(wei) 0 的S0 號標準品即可視為(wei) 陰性對照或者空白；按照說明書(shu) 操作時樣本已經稀釋5 倍，zui終結果乘以5 才是樣本實際濃度。

4. 嚴(yan) 格按照說明書(shu) 中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5. 所有液體(ti) 組分使用前充分搖勻。

洗板方法

1. 手工洗板：甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，每孔加滿洗滌液，靜置1min 後甩盡孔內(nei) 液體(ti) ，在吸水紙上拍幹，如此洗板5 次。

2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。

操作步驟

1. 從(cong) 室溫平衡20min 後的鋁箔袋中取出所需板條，剩餘(yu) 板條用自封袋密封放回4℃。

2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3. 樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體(ti) 100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5. 棄去液體(ti) ，吸水紙上拍幹，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍幹，如此重複洗板5 次（也可用洗板機洗板）。

6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50μL，15min 內(nei) ，450nm 波長處測定各孔的OD 值。

結果判斷

繪製標準曲線：在Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD 值作縱坐標，繪製出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

兔蛋白激酶PKA試劑盒性能

1. 準確性：標準品線性回歸與(yu) 預期濃度相關(guan) 係數R 值，大於(yu) 等於(yu) 0.9900。

2. 靈敏度：zui低檢測濃度小於(yu) 1.0 U/L。

3. 特異性：不與(yu) 其它可溶性結構類似物交叉反應。

4. 重複性：板內(nei) 、板間變異係數均小於(yu) 15%。

5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6. 有效期：6 個(ge) 月