酶和底物  在中zui常用的酶為(wei) HRP和ALP。

    （1）HRP：是一種糖蛋白，含糖量約18％，分子量為(wei) 44kD，在蔬菜作物辣根中含量很高。HRP是一種複合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞(ya) 鐵血紅素） 結合形成一種卟啉蛋白質。主酶為(wei) 五色糖蛋白，在275nm波長處有zui高吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環，是酶的活性基團，在403nm波長處有zui高吸收峰。HRP的純度用純度值（reinhartzahl，RZ）表示，RZ＝A403nm／A275nm，即403nm的吸光度與(yu) 280nm的吸光度之比，高純度HRP的RZ值應≥3．0。HRP質量的另一重要指標是酶活力，以單位（unit，U）表示。用於(yu) 標記的HRP比活性應≥250U／mg。HRP的作用底物為(wei) H202，催化下列反應；
DH2+H202  HRP  D+2H2O

   上式中DH2為(wei) 供氫體(ti) （即底物），H2O2為(wei) 受氫體(ti) 。HRP對受氫體(ti) 的專(zhuan) 一性很高，除H2O2外，僅(jin) 作用於(yu) 小分子醇和尿素的過氧化物。HRP的底物有多種，在ELISA中常用的有：鄰苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基聯苯胺（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-連氮基-雙-3-乙基苯噻唑啉磺酸鹽[2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS]。三者各有優(you) 缺點：OPD是在ELISA中應用zui多的底物，靈敏度高，比色方便，但配成溶液後穩定性差，且有致異變性；TMB經酶作用後由五色變藍色，加酸終止反應後顯黃色，目測對比鮮明，可比色定量，溶液的穩定性也較差，但無致異變性，因此應用日見增多；ABTS雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
   

   （2）ALP：是一種磷酸酯的水解酶，用做示蹤酶的ALP活性應在l 000U／mg以上。ALP常用的底物為(wei) 對硝基苯磷酸鹽（PNP），降解產(chan) 物為(wei) 黃色的對硝基酚。經NaOH終止酶反應後，顏色維持比較穩定。
在中酶作用於(yu) 底物後生成有色物質、熒光物質或導致化學發光，分別可用分光光度計、熒光光度計測量及照度計測量。熒光和化學發光測定的敏感度均高於(yu) 比色測定，標準曲線的線性範圍亦較比色反應寬，測定效果優(you) 於(yu) 常用的比色。