如果用不同的標記物標記不同的核酸探針，隻要互相不影響各自的雜交反應，檢測係統也不相互幹擾，雜交信號易於(yu) 分辨，原則上均能用於(yu) 雙重或多重標記原位雜交。應用非放射性標記探針的雙重標記原位雜交。可克服放射性核素標記探針的分辨率低、時間長以及放射性汙染等缺點。

    1．應用生物素標記探針的雙重標記原位雜交  應用生物素分別標記的兩(liang) 種探針進行雙重標記原位雜交時，雜交反應可用含兩(liang) 種標記探針的雜交液一次進行。因為(wei) 生物素標記探針可用辣根過氧化物酶標記的親(qin) 和素檢測(以3―氨基―9―乙基―卡巴唑為(wei) 底物，陽性反應產(chan) 物為(wei) 紅色)，而標記的探針用堿性磷酸酶標記的來檢測(反應產(chan) 物為(wei) 藍色)，兩(liang) 個(ge) 檢測係統互相無幹擾，所以，標記的親(qin) 和素也可混合在一起一次孵育。但兩(liang) 種酶的呈色反應需要的pH條件相同，故呈色反應需分先後兩(liang) 次進行。

    2．雙重熒光標記原位雜交  利用具有不同顏色的熒光素分別標記不同的核酸探針，可檢測同一組織或細胞內(nei) 兩(liang) 種不同的靶核酸。用不同的熒光素作標記物進行雙重標記原位雜交，有直接法和間接法兩(liang) 種。直接法將具有不同顏色的兩(liang) 種熒光素分別標記兩(liang) 種不同的核酸探針，用其做原位雜交，雜交信號能在熒光顯微鏡下通過選擇不同的激發濾片而直接觀察。此法操作簡便，但敏感性不高。間接法用生物素分別標記兩(liang) 種不同的核酸探針，然後用不同熒光素標記的親(qin) 和素(或抗生物素抗體(ti) )來檢測雜交體(ti) 。間接法比直接法敏感性更高。