一、xl18luck新利實驗目的

1、深入了解ELISA法測定效價(jia) 的原理。

2、掌握ELISA法測定單克隆抗體(ti) 效價(jia) 的方法。

二、實驗原理

    ELISA是以免疫學反應為(wei) 基礎，將抗原、抗體(ti) 的特異性反應與(yu) 酶對底物的催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。免疫酶技術是將酶標記在抗體(ti) /抗原分子上，形成酶標抗體(ti) /酶標抗原，稱為(wei) 酶結合物。該酶結合物的酶在免疫反 應後，作用於(yu) 底物使之呈色，根據顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體(ti) 。ELISA 法是免疫酶技術的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應板(或球)吸附抗原/抗體(ti) ，使之固相化，免疫反應和酶促反應都在其中進行。在每次反應後都要反複洗 滌，這既保證了反應的定量關(guan) 係，也避免了末反應的遊離/抗原的分離步驟。xl18luck新利在ELISA 法中。酶促反應隻進行一次，而 抗原、抗體(ti) 的免疫反應可進行一次或數次，即可用二抗(抗抗體(ti) )、三抗再次進行免疫反應。

   目前常用的幾種ELISA方法有：測定抗體(ti) 的間接法，測定抗原的雙抗體(ti) 夾心法和測定抗原的競爭(zheng) 法等。本實驗采用間接法測定單克隆抗體(ti) 效價(jia) 。其主要過程為(wei) ：首先將已知定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反應板的凹孔內(nei) ，加待測抗體(ti) ，保溫後洗滌以除去未結合的雜蛋白質，加酶標抗抗體(ti) ，保溫後洗滌，加底物保溫30分鍾後，加酸或堿終止酶促反應，用目測或光電 
比色測定抗體(ti) 含量。

三、操作步驟

①抗原包被：兔抗人IgG 作為(wei) 抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應板中。4℃放置。

②洗滌：次日傾(qing) 去凹孔內(nei) 的液體(ti) ，洗滌液洗3次。

③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h.

④洗滌：用洗滌液洗3次。

⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體(ti) 的細胞培養(yang) 上清在另-塊板上用PBS 連續稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到 已包被的板上，每個(ge) 樣品平行做兩(liang) 份，PBS 或空白培養(yang) 基作為(wei) 陰性對照，已知樣品作為(wei) 陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育 1~2h。

⑥洗滌：用洗滌液洗3次。

⑦加酶標抗：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。

⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。

⑨顯色：加新鮮配製的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。

⑩終止反應、比色：加50μL/孔終止液。xl18luck新利顏色變黃；用酶標儀(yi) 測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應的zui大稀釋度為(wei) 待測 
樣品的效價(jia) 。