解決(jue) 方案：

    以上的分析可能對於(yu) 初學者還是不容易的，下麵我就把我的排除實驗的具體(ti) 過程與(yu) 大家進行分享、交流和討論。

1、首先排除孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與(yu) 抗體(ti) 的孵育條件是密不可分的，由於(yu) 用SP法已經做出來過一次且效果不錯，因此對於(yu) 同樣組織的同一抗原進行分析，這種因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育時間是否太長？做出來那一次我是孵育8min，後來也是8-10min，我單獨做了一次實驗來排除該因素。結果孵育2.5min時先出現背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現特異性染色，然後隨著時間的延長，會(hui) 出現非特異性背景著色。

3、zui後，血清封閉的問題？以前我一般孵育15-30min，所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來的那一次，結果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進的同時，也對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數，甚至*參照試劑盒說明書(shu) 來進行操作，以及過氧化氫滅活加強等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個(ge) 實驗流程，與(yu) *次做出來相比，隻有兩(liang) 個(ge) 地方做了改動：因血清不夠而更換了不同試劑盒、因稀釋液用完而重新買(mai) 了抗體(ti) 稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液（我以前還回收抗體(ti) ，自我覺得抗體(ti) 稀釋液中含防腐劑和蛋白穩定劑），其它步驟和組織切片*與(yu) *次做出來的一致（包括血清也是老試劑盒內(nei) 剩餘(yu) 的一點），奇跡出現了：結果很好。——因為(wei) 抗原抗體(ti) 反應除溫度、抗原/抗體(ti) 濃度外，然後就是PH值，於(yu) 是我測了新抗體(ti) 稀釋液、老抗體(ti) 稀釋液和PBS的PH值，結果是前者偏酸性（<6.0），而後兩(liang) 者均在7.5左右。

6、看來主要禍根是稀釋液的PH值出問題了，於(yu) 是我又用PBS替代抗體(ti) 稀釋液和新試劑盒內(nei) 的試劑對組織切片做了免疫組化，結果還是沒有做出來：背景很深。這真把我搞慘了。難道還有什麽(me) 原因嗎？通過仔細分析：一抗一定是結合上去了（老SP試劑盒結果很好），問題是二抗沒有結合上去也不對（因為(wei) zui後背景很深，這說明二抗可能也結合上去了），DAB孵育時間現在隻用1.5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、我做了兩(liang) 張切片：一張用老試劑盒內(nei) 還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內(nei) 的封閉血清，其餘(yu) 試劑（二抗、SP）均用新試劑盒提供的，結果是前一張效果很好，而後一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。——看來封閉血清也是罪會(hui) 禍首之一。