(一)免疫熒光組織化學原理

    將已知抗原或抗體(ti) 標記上熒光素，製成熒光，再用這種熒光抗體(ti) (或抗原)作為(wei) 探針檢查細胞或組織內(nei) 的相應抗原(或抗體(ti) )。在細胞或組織中形成的抗原抗體(ti) 複合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受到激發光的照射會(hui) 發出明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，熒光素受激發光照射，由低能態進入高能態，而高能態的電子不穩定，以輻射光量子的形式釋放能量後，再回到原來的低能態，這時發出明亮的熒光。利用熒光顯微鏡可觀察熒光所在細胞或組織，從(cong) 而確定抗原或抗體(ti) 性質和定位，以及利用定量技術測定含量。

(二)熒光抗體(ti) 染色法

1．直接法

(1)染色：切片經固定後，滴加經稀釋至染色效價(jia) 的熒光抗體(ti) ，在室溫或37℃染色30min。切片置入濕盒內(nei) ，防止幹燥。

(2)洗片：倒去熒光抗體(ti) ，將切片浸入pH 7．2磷酸鹽緩衝(chong) 液(PBS)中洗兩(liang) 次，電磁"振動，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。

(3)50％碳酸鹽緩衝(chong) 甘油(O．5mol／L碳酸鹽緩衝(chong) 液pH 9．O～9．5)封固、鏡檢。

直接法相對簡單，適用於(yu) 細菌、螺旋體(ti) 、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質抗體(ti) 如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體(ti) 隻能檢查一種相應抗原，特異性高而敏感性相對低。

2．間接法(雙層法)

(1)切片固定後用毛細管吸取適當稀釋的免疫血清滴在其上，置於(yu) 濕盒中，37℃作用30min。用O．01mol／LpH 7．2 PBS洗滌兩(liang) 次，每次5min，用濾紙吸去多餘(yu) 液體(ti) 。

(2)再滴加問接熒光抗體(ti) (如兔抗人γ一球蛋白熒光抗體(ti) 等)，同上步驟，37℃染色30min，PBS洗滌兩(liang) 次，每次5mirt，振動，緩衝(chong) 甘油封固，鏡檢。

3．間接法(夾心法)

(1)切片或塗片固定後，置於(yu) 染色濕盒內(nei) 。

(2)滴加未標記的特異性抗原與(yu) 切片作用於(yu) 37℃，30min。

(3)PBS緩衝(chong) 液洗滌2次，每次5min，吹幹。

(4)在切片上滴加特異性熒光，37℃，30 min。

(5)PBS緩衝(chong) 液洗滌兩(liang) 次，每次5min，吹幹。

(6)緩衝(chong) 甘油封固，鏡檢。

4．補體(ti) 方法

(1)材料和方法

1)免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers；鹽水作2倍稀釋，為(wei) 1：2，1：4，1：8…補體(ti) 用10倍稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體(ti) 熒光抗體(ti) 等，按下述補體(ti) 法染色。免疫血清補體(ti) 結合效價(jia) 如為(wei) 1：32，則免疫血清應用l：8倍稀釋。

2)補體(ti) 用新鮮豚鼠血清一般作l：10稀釋或按補體(ti) 結合反應試管法所測定的結果，按兩(liang) 單位的比例，用K。lmers鹽水稀釋備用。

Kolmers鹽水配製是在pH7．4的0．1mol／L PBS中溶解MgSO4，其終濃度為(wei) O．01％。

3)抗補體(ti) 熒光抗體(ti) ：在免疫血清效價(jia) 為(wei) 1：4，補體(ti) 為(wei) 兩(liang) 單位的條件下，用補體(ti) 染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體(ti) 的染色效價(jia) ，然後按染色效價(jia) 1：4的濃度用Kolrners鹽水稀釋備用。

(2)方法

1)塗片或冰凍切片用冷丙酮10min固定和PBS洗滌一次，約3min，吹至組織表麵無水分。

2)吸取經適當稀釋的免疫血清及補體(ti) 的等量混合液(此時免疫血清及補體(ti) 又都各稀釋一倍)滴於(yu) 切片上，37℃作用30min，置於(yu) 濕盒內(nei) 。

3)用PBS緩衝(chong) 液洗滌2次，攪拌或振動混勻，每次5m·n，吸於(yu) 標本周圍水分。

4)滴加經適當稀釋的抗補體(ti) 熒光抗體(ti) ，37℃作用30min，水洗同上。

5)蒸餾水洗滌lmin，緩衝(chong) 甘油封固。

5．膜抗原熒光抗體(ti) 染色法

用直接法或間接法原理及步驟，可對活細胞在試管內(nei) 進行染色，常於(yu) T和B細胞、細貔培養(yang) 物、瘤細胞抗原和受體(ti) 等的研究，陽性熒光主要在細胞膜上。

6．雙重染色方法

(1)一步法雙染色法：先將兩(liang) 種標記抗體(ti) 按適當比例混合(A+B)，按直接方法進行姿色。

(2)二步法雙染色方法：先用RB200標記的B抗體(ti) 染色，不必洗去，再用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)標記的A抗體(ti) 染色，按間接法進行。

(3)結果：經FITC標記的A抗原陽性熒光呈現綠色，經RB200標記的B抗原陽性呈現橘紅色熒光。

(三)熒光抗原染色法

    某些抗原可用熒光素標記，製成熒光抗原，標記熒光素的方法與(yu) 製備熒光抗體(ti) 方法相同：用熒光抗原可直接檢查細胞或組織內(nei) 的相應，特異性較好，敏感性較差。染色方法與(yu) 熒光抗體(ti) 染色的直接染色法相同。由於(yu) 多數抗原難以提純或量少昂貴，一般很少采用此法。