雙抗體(ti) 夾心法檢測抗原

    雙抗體(ti) 夾心法用於(yu) 檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩(liang) 個(ge) 抗原決(jue) 定簇A和B分別與(yu) 固相載體(ti) 上的抗體(ti) A和酶標記B結合，形成抗體(ti) A-待測抗原-酶標抗體(ti) B複合物，複合物的形成量與(yu) 待測抗原含量成正比。

實驗步驟

1．用包被液稀釋包被抗體(ti) 至合適濃度，包被酶聯板，每孔100μL。也可37℃，2小時包被，但此方法不建議使用。包被抗體(ti) 即可以是單抗，也可以是多抗。但抗體(ti) 的包被濃度應當通過預實驗確定。包被的板條可以在4℃保存數月。

2．每孔加入100ul洗滌緩衝(chong) 液，清洗酶聯板3-5次。

3．10%小牛血清封閉，每孔200μL，濕盒中37℃封閉1小時。也可以用1.5%酪蛋白或者0.25%的BSA封閉。

4．每孔加入100ul洗滌緩衝(chong) 液，清洗酶聯板3-5次。zui後一次在吸水紙上扣幹。

5．加標準樣品及樣本。

（1）標準曲線：用1×PBS稀釋標準品分別至1000ng/ml、500ng/ml、250 ng/ml、125 ng/ml、62.5 ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.18 ng/ml。

（2）待測樣品：用1×PBS稀釋（不同樣品的稀釋倍數不同，一般稀釋原則為(wei) 稀釋後的樣品濃度應在標準曲線之內(nei) ）。

（3）以上下做平行孔，前兩(liang) 孔作空白加入1×PBS，其餘(yu) 依次加入標準曲線、待測樣品。加入體(ti) 積每孔100ul。濕盒中37℃反應1小時。

抗原反應比較快，一般1~2小時就達到峰值。延長反應時間容易出現非特異結合。

6．每孔加入100ul洗滌緩衝(chong) 液，清洗酶聯板3-5次。zui後一次在吸水紙上扣幹。

7．加酶標二抗，根據抗體(ti) 使用說明用1×PBS稀釋，每孔100ul濕盒中室溫反應40分鍾。

二抗的使用濃度應當進行預實驗確定，二抗的反應時間不能過長，容易出現非特異反應。

8．每孔加入100ul洗滌緩衝(chong) 液，清洗酶聯板3-5次。zui後一次在吸水紙上扣幹。

9．加底物顯色液：稱取OPD（鄰苯二胺）4mg用10ml底物緩衝(chong) 液充分溶解，加入15ul H202每孔100ul閉光反應5分鍾。OPD要充分溶解，否則容易出現個(ge) 別孔顏色太深。

10．終止液終止反應每孔100ul終止液。

11．酶聯免疫檢測儀(yi) 492nm讀數。

12．以測定的OD值繪製線性回歸標準曲線，以標準品蛋白濃度LN值為(wei) 橫坐標，相應的OD值為(wei) 縱坐標，繪製出一條標準曲線並添加線性回歸趨勢線，其相關(guan) 係數R2應大於(yu) 0.95，根據方程計算出樣品中的目標蛋白含量。