（一）準備和安裝過濾器 

    清洗好過濾器，幹燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超淨台內(nei) 打開過濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體(ti) 中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用泵過濾，過濾後要檢查濾膜是否完好無損。 

（二）合成培養(yang) 基的配製

1、根據目錄中的說明，按下表選擇合適品牌及貨號的培養(yang) 基幹粉，用適量超純水充分溶解。

2、 按要求添加碳酸氫鈉、穀氨酸鈉、HEPES等，充分攪拌使之溶解。

3、 調 pH至7.2左右。

4、 加水至zui終體(ti) 積。

5、 在超淨台中對溶液進行濾過除菌，分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

6、 瓶口封好，4℃冰箱貯存。 

（三）小牛血清的處理 

    市場上出售的小牛血清一般做了滅菌處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過加熱的方法破壞補體(ti) （近來也有觀點認為(wei) 熱滅活處理是不必要的）。胎牛血清不必滅活。

1、 將血清加熱至56℃並保持30 min，其間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉澱析出。

2、 處理後的血清貯存於(yu) 4℃。

3、 小牛血清在使用前進行篩選以掌握血清的質量。 

（四）生長培養(yang) 基的配製 

    除無血清培養(yang) 之外，各種合成培養(yang) 基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 

    培養(yang) 基分裝成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。 

    按如下比例配製： 基本培養(yang) 基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體(ti) 積分數加入雙抗貯存液（青黴素+鏈黴素），使青黴素和鏈黴素的終濃度分別為(wei) 100 U／mL和100 μ／mL，。 

（五）凍存細胞的複蘇 

    應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的迅速放入後將細胞麵浸至水麵以下不斷搖動至融化。 

    在無菌台內(nei) 將*培養(yang) 基加入50ml的小培養(yang) 瓶內(nei) ，約5ml左右，然後用無菌吸管從(cong) 凍存管內(nei) 取出細胞，置培養(yang) 並內(nei) 輕輕搖晃，使細胞均勻後置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 。 

（六）傳(chuan) 代: 

貼壁細胞:

    對於(yu) 貼壁細胞應先吸（倒）盡培養(yang) 基，吸的越幹淨越好，以免中和後加入的消化液，使強度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養(yang) 瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進行消化，（根據經驗），晃動使消化液鋪均勻置37度培養(yang) 箱約2-5分鍾，鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml*培養(yang) 基後，輕輕吹打，使細胞基本成單個(ge) 懸浮，然後分置其它無菌培養(yang) 瓶內(nei) ，加入*培養(yang) 基後繼續培養(yang) 或實驗。 

懸浮細胞:

    一般傳(chuan) 代可直接將細胞原液分置其它培養(yang) 瓶內(nei) ，加入*培養(yang) 基繼續培養(yang) ，如要高濃度可先離心1000rpm，5min後加入*培養(yang) 基，輕輕吹勻後，分置其它培養(yang) 瓶內(nei) 加入*培養(yang) 基繼續培養(yang) 。 

（七）凍存 

    將貼壁細胞消化後離心收集，懸浮直接離心收集，以*培養(yang) 基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

（八）注意事項 

    玻璃吸管和玻璃培養(yang) 瓶的消毒:1）高壓蒸汽滅菌15分鍾以上;2）幹烤消毒140度2小時以上; 

    無菌工作台先清洗後用75%酒精擦拭幹淨，紫外線照射40分鍾以上;各種培養(yang) 板照射3小時以上; 

    培養(yang) 基（pH7.2）和血清配製好後要做無菌試驗:將血清按10%加入培養(yang) 基內(nei) ，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取*培養(yang) 基5-10ml置培養(yang) 箱內(nei) 培養(yang) 2-3天，肉眼見無渾濁或沉澱等異物。分裝後置4度保存; 

    消化液（pH7.8）或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存; 

    培養(yang) 箱應先用清水清洗後用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌）。至少每月一次。 

    進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然後用75%酒精擦拭，操作時注意無菌台內(nei) 空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數量較多，培養(yang) 瓶應放在與(yu) 酒精燈平行地方便於(yu) 操作，瓶與(yu) 瓶之間應相隔一定的距離，開瓶（蓋）時應先用75%酒精反複擦拭或用燈燒，打開後應用燈先燒口，然後燒蓋。用完後同樣操作。整個(ge) 操作過程盡量在無菌台靠裏麵一點。