1.注意要點

（1）探針蛋白的本質與(yu) 相互作用蛋白的來源：探針蛋白的本質：是全長蛋白、相互作用相關(guan) 的結構域，甚至是化學合成的較小的生物活性片段。相互作用蛋白的來源：已知內(nei) 源性表達探針蛋白的係是尋找與(yu) 其相互作用蛋白的理想實驗材料。

（2）細胞裂解物的製備：成功製備細胞粗提物的關(guan) 鍵因素包括：細胞的裂解方式；pH的控製；溫度；避免蛋白的降解。這些都需要在預實驗中多次重複來優(you) 化細胞裂解條件。提取重組蛋白有時不必破碎細胞。例如，許多高表達的哺乳細胞係（尤其是中國倉(cang) 鼠卵巢細胞，CHO細胞）和酵母細胞株（如Pichiapastoris）已經被改造得可以分泌重組蛋白，因而可以直接從(cong) 細胞條件培養(yang) 基和培養(yang) 濾出液中純化重組蛋白。使用這些方法很重要的一點是要盡可能快地濃縮大量的細胞條件培養(yang) 基，使之盡快進入“無蛋白酶的環境”。

2.疑難分析解答

（1）結合過程中的參數：發現和證實蛋白質的相互作用，與(yu) 這些蛋白質在自然狀態下相互作用的穩定程度密切相關(guan) 。這種穩定程度決(jue) 定了我們(men) 采用什麽(me) 樣的體(ti) 外結合條件。在自然狀態下那些參與(yu) 結構的蛋白質相互作用往往是極其穩定的，而在酶作用或蛋白轉運過程中出現的蛋白質相互作用卻短暫而不穩定。

    穩定的蛋白質相互作用能夠在較長的時間中仍保持相互作用關(guan) 係，是zui容易用GST沉降實驗證實或發現的蛋白質相互作用。對於(yu) 這些較強的蛋白質相互作用我們(men) 可以在較廣泛的結合條件下都能夠得到結果，往往我們(men) 常選用強離子濃度的緩衝(chong) 體(ti) 係避免非特異的蛋白質相互作用，從(cong) 而降低假陽性的出現。如果蛋白複合體(ti) 相互作用較弱，具有較高的解離常數，那麽(me) 我們(men) 常通過pH、離子強度以及不同的緩衝(chong) 體(ti) 係來調整蛋白質的體(ti) 外相互作用體(ti) 係。

    用GST沉降實驗來證實和探索自然中短暫而弱的蛋白質相互作用，則是一項較為(wei) 困難的實驗。這種蛋白質的相互作用往往很難用GST沉降實驗類似的方法來完成。因為(wei) 在實驗過程這種蛋白質相互作用很可能就發生了解離。而這種短暫而弱的相互作用往往發生在酶發揮活性和蛋白質的轉運過程中，在這些過程中常需要其他輔助因子的存在以及能量的參與(yu) （如NTP的水解產(chan) 生的能量）。因此，要用GST沉降實驗完成短暫而弱的蛋白質相互作用分析，就應該在反應體(ti) 係中加入恰當的輔助因子以及能量，模擬一個(ge) 和自然狀態很接近的相互作用體(ti) 係。

（2）蛋白複合物的洗脫

    在鑒定誘餌蛋白和靶蛋白過程中，需要將蛋白複合物從(cong) 標簽蛋白發揮親(qin) 和作用的基質上洗脫下來，SDS-PAGE的上樣緩衝(chong) 液和標簽蛋白的競爭(zheng) 物都能夠作為(wei) 洗脫工作液。SDS-PAGE的上樣緩衝(chong) 液作為(wei) 洗脫工作液往往具有更強的洗脫能力，但是也會(hui) 導致蛋白複合物的變性。另外，上樣緩衝(chong) 液可以從(cong) 基質上洗脫下能和親(qin) 和基質發生強相互作用的非特異結合蛋白質以及導致基質的脫落，這些都會(hui) 影響後續的鑒定分析。而標簽蛋白競爭(zheng) 性洗脫工作液，能夠特異的洗脫下誘餌蛋白-靶蛋白複合物，而且還是一種非變性的洗脫方法，能夠保持蛋白質複合體(ti) 的自然空間狀態，有利於(yu) 某些隨後的分析。

    另外一種洗脫方法能夠選擇的將靶蛋白洗脫下來，而保持誘餌蛋白仍和親(qin) 和基質相連。這種方法常采用步進式的增強鹽離子濃度或降低pH。這種方法也是一種蛋白質非失活的洗脫方法，同時還能夠提供蛋白質相互作用強弱的相關(guan) 消息。

（3）沉降實驗中對照的設立

    在所有沉降實驗中對照實驗的設立都是必須的。在陰性對照實驗中隻加入親(qin) 和基質和靶蛋白混合液，而不加誘餌蛋白，從(cong) 而能夠幫助排除和親(qin) 和基質發生非特異結合的假陽性。在另一組陰性對照實驗組中，隻有親(qin) 和基質、誘餌蛋白和無靶蛋白的蛋白混合液，從(cong) 而能夠幫助排除和誘餌蛋白中的標簽蛋白非特異結合的假陽性，這一組對照實驗組也能夠作為(wei) 陽性對照，說明親(qin) 和基質能夠有效的捕捉帶標簽的融合誘餌蛋白。