實驗原理
用純化的DAG包被微孔板，製成固相載體(ti) ，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的DAG抗體(ti) 、HRP標記的親(qin) 和素，經過*洗滌後用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的DAG呈正相關(guan) 。用酶標儀(yi) 在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。 
 
試劑盒組成及試劑配製 
1、 酶標板：一塊（96孔） 
2、 標準品（凍幹品）： 2瓶，請臨(lin) 用前15分鍾內(nei) 配製。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好後室溫靜置大約10分鍾，同時反複顛倒/搓動以助溶解，其濃度為(wei) 400 ng/ml，將其稀釋為(wei) 40 ng/ml後，再做係列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配製成40 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，樣品稀釋液直接作為(wei) 空白孔 0 ng/ml。如配製20 ng/ml標準品：取0.5ml （不要少於(yu) 0.5ml ）40 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其餘(yu) 濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨(lin) 用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配製（100 /孔），實際配製時應多配製 0.1-0.2ml。
7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨(lin) 用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5張
12、使用說明書(shu) ：1份
 
 
 
自備物品 
1、 酶標儀(yi) （建議儀(yi) 器使用前提前預熱）
2、 微量加液器及吸頭，EP管
3、 蒸餾水或去離子水，濾紙 
 
標本的采集及保存 
1、 血清：全血標本請於(yu) 室溫放置2小時或4 過後於(yu) 1000 g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將上清置於(yu) -20 或-80 保存，但應避免反複凍融。
2、 血漿：可用EDTA或肝素作為(wei) 抗凝劑，標本采集後30分鍾內(nei) 於(yu) 1000 g離心15分鍾，取上清即可檢測，或將上清置於(yu) -20 或-80 保存，但應避免反複凍融。
3、 組織勻漿：將動物的組織標本先用PBS洗滌，去除多餘(yu) 血液，勻漿化後放在5~10 ml PBS中於(yu) -20℃放置過，第二天，經過二次反複凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鍾，取上清即可檢測。
4、 其它生物標本：請1000 g離心20分鍾，取上清即可檢測，或將上清置於(yu) -20 或-80 保    存，但應避免反複凍融。
 
注：以上標本均應密封保存，4保存應小於(yu) 1周，-20不應超過1個(ge) 月，-80不應超過2個(ge) 月；標本溶血會(hui) 影響zui後檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
 
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配製時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋後的樣品符合試劑盒的檢測範圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數。
1、 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 ，餘(yu) 孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加於(yu) 酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為(wei) 保證實驗結果有效
性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體(ti) ，甩幹，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨(lin) 用前配製），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
3、 棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板 3次，每次浸泡1-2分鍾，大約400 /每孔，甩幹（也可輕拍將孔內(nei) 液體(ti) 拍幹）。 
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨(lin) 用前配製）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。
5、 棄去孔內(nei) 液體(ti) ，甩幹，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應時間控製在15-30分鍾，當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，後3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與(yu) 底物    液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀(yi) 在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）。
 
注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應平衡至室溫，使用後請立即按照說明書(shu) 要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉汙染。
2、 加樣：加樣或加試劑時，*個(ge) 孔與(yu) zui後一個(ge) 孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會(hui) 導致不同的 “預溫育”時間，從(cong) 而明顯地影響到測量值的準確性及重複性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控製在10分鍾內(nei) 。推薦設置複孔進行實驗。
3、 溫育：為(wei) 防止樣品蒸發，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置於(yu) 濕盒內(nei) ，以避免液體(ti) 蒸發；洗板後應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處於(yu) 幹燥狀態；同時應嚴(yan) 格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍幹，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體(ti) 和手指印，避免影響zui後的酶標儀(yi) 讀數。
5、 試劑配製：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體(ti) 沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據所需的量配製使用，並使用相應的稀釋液配製，不能混淆。請配製標準品及工作液，盡量不要微量配製（如吸取檢測溶液A時，一次不要小於(yu) 10 ），以避免由於(yu) 不準確稀 釋而造成濃度誤差；請勿重複使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應時間的控製：加入底物後請定時觀察反應孔的顏色變化（比如，每隔10分鍾），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從(cong) 而影響酶標儀(yi) 光密度讀數。
7、 底物：底物請避光保存，在儲(chu) 存和溫育時避免強光直接照射。
     
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩衝(chong) 液至少0.4ml注入孔內(nei) ，浸泡1-2分鍾，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nei) 的液體(ti) ，在實驗台上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據需要，重複此過程數次。
2、 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用後再用到正式實驗過程中。
 
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠DAG，且與(yu) 其它相關(guan) 蛋白無交叉反應。
 
計算
 各標準品及樣本 值扣除空白孔 值後作圖（七點圖），如設置複孔，則 應取其平均值計算。以標準品的濃度為(wei) 縱坐標（對數坐標），值為(wei) 橫坐標（對數坐標），在對數坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專(zhuan) 業(ye) 製作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據樣品值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與(yu) 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為(wei) 樣品的實際濃度。