一、器材

剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術鑷子（遊離血管用）一把、直頭眼科手術剪（剪血管用）一把，手術刀架，手術刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑450px）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩(liang) 把，手術縫合線，塑料放血管，紗布等。

二、兔子的選擇

兔子的重量應在四斤以上，兩(liang) 耳光滑，明顯可見耳靜、動脈，健康。

三、免疫

用生理鹽水稀釋免疫原，然後與(yu) 相應的佐劑進行1:1混合。抗原和佐劑*混合形成穩定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和後大腿進行肌肉注射。每個(ge) 區域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從(cong) 而提高免疫應答。

注：

抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體(ti) 時作為(wei) 陰性對照。待兔子在新環境中穩定，大概需要四天左右時間，可以進行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。

免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體(ti) 的質量。抗原經FCA或FIA充分乳化後才能注射。將抗原液與(yu) 佐劑等比例混合後，置於(yu) 混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費時、費力，但若乳化不充分，會(hui) 影響免疫的效果，振蕩後，1000rpm離心一分鍾，如水相和油相不分層即可注射。免疫用FCA，以後都用FIA。

免疫方法可采用背部多點注射法。即於(yu) 家兔脊柱兩(liang) 旁選4-6點皮下注射，每點注0.1ml，間隔2周後再於(yu) 上述部位選不同點注射（不要選擇臨(lin) 近位點，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數在四五次即可，抗原用量大可以減少次數。

四、試劑

生理鹽水（或PBS）

弗氏*佐劑（Freund’s complete adjuvant， FCA）

弗氏不*佐劑（Freund’s incomplete adjuvant， FIA）

二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3

五、免疫原：蛋白或KLH偶聯的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

六、取血：

免疫一周後，可以耳動脈取血檢測抗體(ti) 效價(jia) 。因為(wei) 起初幾次免疫產(chan) 生的抗體(ti) 的效價(jia) 比較低，頭兩(liang) 次取血，夠檢測用即可。在三次免疫後，可以獲得較價(jia) 的抗體(ti) ，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會(hui) 造成兔子貧血。

前幾次取血用19號針頭對兔子進行耳動脈取血，室溫析出血清。

zui後一次取血可以采用頸動脈放血，具體(ti) 操作如下：

1、家兔仰臥於(yu) 兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛並消毒皮膚。

2、沿頸部中線用手術刀切開皮膚約250px，分離皮下結締組織，直至暴露出氣管兩(liang) 側(ce) 的胸鎖乳突肌（小心操作，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）。

3、用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與(yu) 氣管間的頸三角區疏鬆組織，暴露出頸總動脈後用彎頭眼科鑷使之遊離，剝離神經和結締組織。

4、於(yu) 動脈下套入兩(liang) 根黑絲(si) 線，分別置於(yu) 遠心及近心端。結紮遠心端的絲(si) 線。近心端的動脈用血管夾夾住。

5、用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術剪在兩(liang) 根絲(si) 線間的動脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲(si) 線結紮固定於(yu) 放血管上，以防放血管滑脫。

6、鬆開止血鉗，使血液流入容器中。一般一隻家兔可放血100-120ml。

七、血清的分離

如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾(qing) 斜放置於(yu) 37oC烘箱2h，轉移到4oC沉澱，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2h，轉移到4oC沉澱，第二天早上離心，10000RCF，10分鍾。在血清中加入NaN3 至終濃度0.02%，分裝後-20oC保存。