PCR 實用技巧
增加PCR的特異性： 
1. primers design 
這是zui重要的一步。理想的，隻同目的序列兩(liang) 側(ce) 的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下麵的 一些條件 
a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會(hui) 降低特異性,並且降低產(chan) 量 
b. GC% 40%~~~~60% 
c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性 
d. 避免3'端GC rich, zui後3個(ge) BASE不要有GC,或者zui後5個(ge) 有3個(ge) 不要是GC 
e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER 
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內(nei) 部形成二級結構 
h. 附加序列（RT site, Promoter sequence）加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們(men)  
i. 使用兼並引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼並引物,並使用 較高的引物濃度（1uM-3uM） 
j. 學會(hui) 使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online　desgin et al. 
* 引物的另一個(ge) 重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為(wei) 雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對於(yu) 設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火， 同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從(cong) 55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。 
設定Tm有幾種公式。有的是來源於(yu) 高鹽溶液中的雜交，適用於(yu) 小於(yu) 18堿基的引物。 
有的是根據GC含量估算Tm。確定引物Tmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從(cong) 序列一級結構和 相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(hui) 差異很大。因為(wei) 大部分公式提供一個(ge) 估算的Tm值，所有退火溫度隻是一個(ge) 起始點。可以通過分析幾個(ge) 逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於(yu) 估算的Tm5℃，以2℃為(wei) 增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(hui) 減少引物二聚體(ti) 和非特異性產(chan) 物的形成。 
為(wei) 獲得*結果，兩(liang) 個(ge) 引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會(hui) 引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩(liang) 個(ge) 引物Tm不同，將退火溫度設定為(wei) 比zui低的Tm低5℃ 
或者為(wei) 了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個(ge) 循環，然後在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘(yu) 的循環。這使得在較為(wei) 嚴(yan) 緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。2. stability of primers 
定製引物的標準純度對於(yu) 大多數PCR應用是足夠的。 
引物產(chan) 量受合成化學的效率及純化方法的影響。定製引物以幹粉形式運輸。在TE重溶引物，使其zui終濃度為(wei) 100μM。TE比去離子水好，因為(wei) 水的pH經常偏酸，會(hui) 引起寡核苷的水解。 引物的穩定性依賴於(yu) 儲(chu) 存條件。應將幹粉和溶解的引物儲(chu) 存在-20℃。以大於(yu) 10μM濃度溶於(yu) TE的引物在 -20℃可以穩定保存6個(ge) 月，但在室溫（15℃到30℃）僅(jin) 能保存不到1周。幹粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）zui多可以保存2個(ge) 月。 

3. optimize reactants concentration 
a. magnesiom ions 
Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與(yu) 核酸骨架相互作用 並能影響Polymerase的活性，一般的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調整，同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度後要相應的調整Mg離子的濃度，對實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液 
b. 其他的離子 
NH4+ K+都會(hui) 影響PCR，增加K+的濃度後, 會(hui) 因為(wei) 中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從(cong) 而降低了PCR的 嚴(yan) 謹性（stringency），NH4+也有相同的作用.TAQ酶就提供了兩(liang) 種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經混合了（NH4）2SO4的，當然, 過高的陽離子濃度（KCL>0.2M）時, DNA在94度根本不會(hui) 發生變性, 當然也就無從(cong) 談起PCR了. 
c. polymerase 
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度，一些高保真沒的效率要遠遠低於(yu) Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從(cong) 而保證polymerase的活性 
d. template 
50ul PCR SYSTEM 
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human gDNA 0.1ug-1ug 
E.Coli 10ng-100ng 
LamadaDNA 0.5ng-5ng 
Plasmid DNA 0.1ng-10ng 
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4. termperature 
a. denaturation 
常規是94度5分鍾, GC Rich的摸板是95度5分鍾 
除了GC Rich外, 常規的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鍾, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation 
b. annealing 
重點到了：一般情況下, 是從(cong) 55度開始.根據情況配合以Mg離子濃度進行調整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為(wei) , polymerase 在 annealing temp.時也會(hui) 有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會(hui) 極大的增加非特異性擴增的風險，另外,在對於(yu) 一些困難戶, 比如從(cong) gDNA裏擴增大片段, 還可使用two step PCR. 
5. touchdown PCR 
原理很簡單,但的確是一個(ge) 很有用的方法。舉(ju) 個(ge) 例子，ANNEALING TEMP. 55度 
94 5min 
94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 
94 30s 59 30s72 1min 2cycles
94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 
94 30s 51 30s 72 1min 2cycles 
94 30s 50 30s 72 1min 20cycles 
72 5min 

6. hot start PCR 
熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性zui重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的*延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配製過程中，以及在熱循環剛開始，保溫溫度低於(yu) 退火溫度時會(hui) 產(chan) 生非特異性的產(chan) 物。這些非特異性產(chan) 物一旦形成，就會(hui) 被有效擴增。在用於(yu) 引物設計的位點因為(wei) 遺傳(chuan) 元件的定位而受*，如site-directed突變、表達克隆或用於(yu) DNA工程的遺傳(chuan) 元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為(wei) 有效。 
限製Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配製PCR反應液，並將其置於(yu) 預熱的PCR儀(yi) 。這種方法 簡單便宜，但並不能完成抑製酶的活性，因此並不能*消除非特異性產(chan) 物的擴增。 
熱啟動通過抑製一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀(yi) 達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合 酶，在反應體(ti) 係達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個(ge) 方法 過於(yu) 煩瑣， 尤其是對高通量應用，並容易造成汙染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本 成分，入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩衝(chong) 液，物理地隔離開。在熱循環時， 因蠟熔化而把各種成分釋放出來並混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。 
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ampliwax PCR Gems （Perkin Elmer） 
Taq Bead Hot Start Polymerase （Promega） 
Magnesium wax beads （Stratagene）. 
=========================象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易於(yu) 汙染，不適用於(yu) 於(yu) 高通量應用。 
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體(ti) 抑製失活，當變性溫度超過70度時，抗體(ti) 也變性了，這樣polymerase又被激活了。 

7. Booster PCR 
我們(men) 知道1ug human genomic DNA 大約在3X10 5冪個(ge) 模板分子,這樣的模板分子數目可以是引物與(yu) 模板很好的結合. 當模板的濃度過低,比如低於(yu) 100個(ge) 分子時, 引物和模板之間就很難發生反應. 引物容易自身進行反應形成二聚體(ti) .這樣就有來了個(ge)  booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個(ge) booster. 
具體(ti) 是這樣的.開始幾個(ge) cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以確保開始擴增的準確性.然後booste Primer的濃度到正常的水平 

8. 循環數和長度 
確定循環數的基本原理是: 產(chan) 物能夠保證你進一步分析操作的zui小循環數.因為(wei) 過多的循環數容易造 成ERRORS和非特異性產(chan) 物的積累 產(chan) 物的量不夠, 優(you) 化的方法有: 
1. 增加TEMPLATE 
2. 增加循環數 
如何確定循環數,有一個(ge) 方法. 
做一個(ge) PCR體(ti) 係,40循環,50ul, 分別在20,25,30,35循環時從(cong) 體(ti) 係中取5ul,一起跑電泳分析.從(cong) 而確定*的循環數 
另一個(ge) 會(hui) 影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩(liang) 個(ge) 溫度間變化的速率（ramping rate）.當然是越高 越好.不過咱們(men) 大部分條件有限,就那麽(me) 幾台PCR儀(yi) ,也沒有多少挑選的餘(yu) 地 

9. thermal cycler 
PCR儀(yi) 的因素我們(men) 經常容易忽視.長時間的使用後需要調整PCR儀(yi) ,以保證其能夠到達正確的溫度.現在的PCR儀(yi) 基本上都有自檢功能（self-diagnosis）. 

10. PCR additives 
附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應退火效率的化學因子, DNA結合蛋白和一些商業(ye) 試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chan) 物的長度和產(chan) 量. 
在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩定,從(cong) 而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由於(yu) 造成錯配的primer-template複合物的極大的不穩定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有的enhancer全部通用,需要你根據自己的情況,結合gradient pcr選擇*條件. 
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dimethyl sulfoxide（DMSO） up to 10% 
formamide at 5% 
trimethylammonium chloride 10-100uM 
detergents such as Tween 20 0.1-2.5% 
polyethylene glycol （PEG）6000 5-15% 
glycerol 10-15% 
single stranded DNA binding proteins 
Gene 32 protein 1nM 
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM 
7 deaza-dGTP（for GC rich） 150uM with 50uM dGTP 
Taq Extender （stratagene） 
Perfect Match PCR Enhancer（stratagene） 
Q-solution（Qiagen） 
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會(hui) 抑製polymerase的活性,所以需要scouting出zui適的濃度 

11. Template DNA preparation 
提取DNA時的試劑會(hui) 抑製PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS（<0.01%） 的情況下就能強烈抑製PCR的進行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑製SDS. 還有proteinase K也要除幹淨, 不然會(hui) 降解polymerase. 12. Nested PCR 
簡單點說 設計兩(liang) 對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內(nei) 的, 用長引物擴增的產(chan) 物作為(wei) 第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chan) 物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況. 

增加PCR的保真性 

高保真酶 
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為(wei) 模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型 
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體(ti) .這類酶的合成能力強,因為(wei) 他不糾正合成中出現的突變 
b.與(yu) a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們(men) 能以RNA為(wei) 模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase 
c.有DNA聚合活性,沒有逆轉錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chan) 量比Taq DNA聚合酶低。 

酶的混合物 
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，並可以得到高產(chan) 量及擴增長模板。 

其他因素 
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(hui) 降低忠實性。將dNTP的濃度從(cong) 200μM降低到25-50μM可以增加度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會(hui) 受影響。進行較少的PCR循環也會(hui) 有助於(yu) 增加忠實性，因為(wei) 增加循環數目和產(chan) 物長度就會(hui) 增加突變可能性。 

1．簡介 
寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個(ge) 擴增反應成功的關(guan) 鍵。所選的引物序列將決(jue) 定PCR產(chan) 物的大小、位置、以及擴增區域的Tm值這個(ge) 和擴增物產(chan) 量有關(guan) 的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產(chan) 物的產(chan) 生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產(chan) 量：若使用設計粗糙的引物，產(chan) 物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產(chan) 物量可接近於(yu) 反應指數期的產(chan) 量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優(you) 化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞(ya) 碸、甲酰胺和甘油。 
計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易於(yu) 在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關(guan) 引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調整各項參數，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體(ti) “質量”（由用戶在程序參數中設定）保證優(you) 於(yu) 通過人工導出的引物。 
需要指出的是，引物不必與(yu) 模板*同源，因此可包含啟動子序列、限製酶識別位點或5’端的各種修飾，這種對引物的修飾不會(hui) 妨礙PCR反應，而會(hui) 在以後使用擴增子時發揮作用。 

2．基本PCR引物設計參數 
引物設計的目的是在兩(liang) 個(ge) 目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率。特異性不好或劣等的引物會(hui) 產(chan) 生額外無關(guan) 和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環中一對引物擴增的產(chan) 物與(yu) 理論上成倍增長量的接近程度。 
①引物長度； 
特異性一般通過引物長度和退火溫度控製。如果PCR的退火溫度設置在近於(yu) 引物Tm值（引物/模板雙鏈體(ti) 的解鏈溫度）幾度的範圍內(nei) ，18到24個(ge) 堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發的模板越少。為(wei) 優(you) 化PCR反應，使用確保溶解溫度不低於(yu) 54℃的zui短的引物，可獲得的效率和特異性。 
總的來說，在特異性允許的範圍內(nei) 尋求安全性。每增加一個(ge) 核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數應用的zui短引物長度為(wei) 18個(ge) 核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用於(yu) 多種實驗條件仍不失為(wei) 明智之舉(ju) 。 
②引物的二級結構 
包括引物自身二聚體(ti) 、發卡結構、引物間二聚體(ti) 等。這些因素會(hui) 影響引物和模板的結合從(cong) 而影響引物效率。對於(yu) 引物的3’末端形成的二聚體(ti) ，應控製其ΔG大於(yu) -5.0kcal/mol或少於(yu) 三個(ge) 連續的堿基互補，因為(wei) 此種情形的引物二聚體(ti) 有進一步形成更穩定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發卡結構，也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大；影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與(yu) 莖環結構形式亦有很大的關(guan) 係。應盡量避免3’末端有發卡結構的引物。 
③引物GC含量和Tm值 
PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個(ge) 堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃範圍內(nei) ，這可為(wei) 有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協調。協調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為(wei) 降低了Tm值導致特異性的喪(sang) 失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能*不發揮作用。在從(cong) 一批在特定序列範圍內(nei) 已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協調非常關(guan) 鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產(chan) 物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度範圍內(nei) 較好。 
④引物的額外序列與(yu) 退火溫度 
若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限製酶切位點或者GC發夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關(guan) 序列不會(hui) 影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與(yu) 模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個(ge) 擴增循環；然後在假定引物5’端序列已經加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其餘(yu) 的循環。 
在引物上添加限製酶位點時一個(ge) 重要的考慮是大多數限製酶的有效切割要求在它們(men) 的識別序列的5’端有2至3個(ge) 非特異的額外堿基，這樣就會(hui) 增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個(ge) 缺點是影響溶解溫度的計算，而這對於(yu) 確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對於(yu) 低於(yu) 20個(ge) 堿基的引物，Tm值可以根據Tm=4（G+C）+2（A+T）計算。而對於(yu) 較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從(cong) “zui近鄰位”的計算方式得到，現有的PCR引物設計軟件大多數都采用這種方式。 
⑤引物的3’末端核苷酸組成 
引物3’末端和模板的堿基*配對對於(yu) 獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端zui後5到6個(ge) 核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償(chang) 這種錯配不會(hui) 有什麽(me) 效果，反應幾乎注定要失敗。 
引物3’末端的另一個(ge) 問題是防止一對引物內(nei) 的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體(ti) 的出現，這樣獲得的PCR產(chan) 物其實是引物自身的擴增。這將會(hui) 在引物雙鏈體(ti) 產(chan) 物和天然模板之間產(chan) 生競爭(zheng) PCR狀態，從(cong) 而影響擴增成功。 
引物3’末端的穩定性由引物3’末端的堿基組成決(jue) 定，一般考慮末端5個(ge) 堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3’末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易於(yu) 異位引發。 
需要注意的是，引物3’末端應盡量避免T。實驗證明，以T結尾的引物即使與(yu) T, G或C錯配仍可有效延伸。 
⑥PCR產(chan) 物的長度及在耙序列內(nei) 的位置 
所有的計算機程序都提供對PCR產(chan) 物長度範圍的選擇。一般說來，PCR產(chan) 物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產(chan) 物長度部分取決(jue) 於(yu) 模板材料。 
預期產(chan) 物的特定長度經常取決(jue) 於(yu) 應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨(lin) 床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴增產(chan) 物可能是的。產(chan) 物應具有好的特異性和高的產(chan) 生效率，並含有能用於(yu) 探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度範圍的產(chan) 物可以通過采用兩(liang) 步擴增循環方法得到，從(cong) 而減少擴增時間。 
其他PCR方法有不同的*產(chan) 物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產(chan) 物應該足夠大以便構成競爭(zheng) 性模板，這樣，產(chan) 物和競爭(zheng) 物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產(chan) 物一般在250～750bp範圍內(nei) 。 
⑦補充說明 
若在cDNA序列內(nei) 找尋PCR引物，需特別注意兩(liang) 點：首先，盡力將引物和產(chan) 物保持在mRNA的編碼區域內(nei) ，因為(wei) 這是生成蛋白質的*序列，不像3’末端非編碼區域與(yu) 許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產(chan) 物與(yu) 從(cong) 汙染DNA中產(chan) 生的產(chan) 物在大小上相區別。 
若PCR的目的是克隆一個(ge) 基因或cDNA的特異序列，產(chan) 物的大小是根據具體(ti) 應用預選的。在這裏，計算機程序可以提供關(guan) 於(yu) 期望區域側(ce) 翼選擇引物對的信息。 
在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5’和3’末端非翻譯區序列，因為(wei) 它們(men) 可能沒有任何的同源性。 

3．簡並引物設計 
①設計簡並引物時，一定要檢查靶擴增區域選定氨基酸遺傳(chuan) 密碼的簡並度。很顯然，我們(men) 期望選擇簡並度zui低的氨基酸，達到提高特異性的目的。 
②充分注意物種對於(yu) 密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡並性。 
③應努力避免3’末端的簡並，對於(yu) 大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位於(yu) 密碼子的第三位。④在一些多義(yi) 位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡並堿基。 

4． 測序引物設計 
當然，測序引物的設計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設計的話；那麽(me) 除了按照上麵所提到的引物設計通用標準外，還需要注意兩(liang) 點： 
①測序引物的特異性的標準掌握應該更嚴(yan) 格一些，也就是說設計時更優(you) 先考慮特異性。因為(wei) 在測序反應中，如果引物與(yu) 模板在非預期位置退火並引發鏈延伸，會(hui) 對結果對來很大的幹擾甚至造成結果無法識讀。 
②測序引物的Tm值適當高一些。現在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，並采用PCR的熱循環程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助於(yu) 使反應順利跨過待測模板的二級結構區，也有助於(yu) 降低非特異反應。 

5． 探針的設計 
探針的設計，根據不同的用途各有其設計特點，這裏隻是就通用的原則進行討論： 
①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。 
②注意G和C的含量努力控製在40-60％，同時一種堿基連續重複不超過4個(ge) ，以免非特異性雜交產(chan) 生。 
③探針自身序列不能形成二聚體(ti) ，也不能有“發夾”結構存在，這一點上的要求就要比普通引物設計嚴(yan) 格得多。 
④如果探針地靶目標是多個(ge) 基因的混合物，就必須控製該探針與(yu) 無關(guan) 基因之間的相似性在70%以下。 
PCR中常見問題分析與(yu) 對策． 
PCR產(chan) 物的電泳檢測時間 
一般認為(wei) PCR產(chan) 物應在48h以內(nei) 完成電泳檢測，有些於(yu) 當日電泳檢測，大於(yu) 48h後帶型就會(hui) 出現不規則，甚至消失。 

Trouble shooting guide 
1．假陰性，不出現擴增條帶 
PCR反應的關(guan) 鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與(yu) 特異性，③酶的質量， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。 
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑製劑，③模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體(ti) 中的組蛋白，④在提取製備模板時丟(diu) 失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不*。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。 
酶失活：需更換新酶，或新舊兩(liang) 種酶同時使用，以分析是否因為(wei) 酶的活性喪(sang) 失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。 
引物：引物質量、引物的濃度、兩(liang) 條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩(liang) 條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為(wei) ：①選定一個(ge) 好的引物合成單位。②引物的濃度不僅(jin) 要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩(liang) 引物帶的亮度應大體(ti) 一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決(jue) 。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體(ti) 等。 
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chan) 量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 
反應體(ti) 積的改變：通常進行PCR擴增采用的體(ti) 積為(wei) 20μl、30μl、50μl或100μl，應用多大體(ti) 積進行PCR擴增，是根據科研和臨(lin) 床檢測不同目的而設定，在做小體(ti) 積如20μl後，再做大體(ti) 積時，一定要重新摸索條件，否則容易失敗。 
物理原因：溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與(yu) 模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下PCR儀(yi) 或水浴鍋內(nei) 的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。 
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與(yu) 模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與(yu) 模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(hui) 成功的。 

2．假陽性 
引物設計不合適：選擇的擴增序列與(yu) 非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chan) 物為(wei) 非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。 
靶序列或擴增產(chan) 物的交叉汙染：這種汙染有兩(liang) 種原因：一是整個(ge) 基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決(jue) ：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nei) 或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拚接，與(yu) 引物互補後，可擴增出PCR產(chan) 物，而導致假陽性的產(chan) 生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。 
3．出現非特異性擴增帶 
PCR擴增後出現的條帶與(yu) 預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與(yu) 非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與(yu) 靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體(ti) 。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關(guan) 。其次，是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶的量過多有時也會(hui) 出現非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設計引物。②減低酶的量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與(yu) 延伸，也叫兩(liang) 步法）。 
4．出現片狀拖帶或塗抹帶 
PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於(yu) 酶的量過大或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶的量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環次數