特異性因素： 固相載體(ti) 的選擇。ELISA中常用的固相載體(ti) 有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為(wei) 常見。包被物的純度。在酶聯免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決(jue) 於(yu) 使用抗原的純度。包被抗體(ti) 的效價(jia) 。具有高親(qin) 和力和高特異性的包被抗體(ti) ，是決(jue) 定試劑特異性的重要方麵。封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體(ti) 表麵尚未被所占據的空隙，減少後續步驟中非特異性蛋白的幹擾。
雙抗體(ti) 夾心法是檢測抗原zui常用的方法：
但要注意的是在一步法（待測抗原與(yu) 酶標抗體(ti) 一起加入反應）測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體(ti) 及酶標抗體(ti) 結合，而不再形成“夾心複合物"出現鉤狀效應，甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測範圍的zui高值。用高親(qin) 和力的單克隆抗體(ti) 製備此類試劑可削弱鉤狀效應。 雙抗體(ti) 夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的幹擾。RF是一種自身抗體(ti) ，多為(wei) IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體(ti) 夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與(yu) 固相抗體(ti) 和酶標抗體(ti) 結合，表現出假陽性反應。雙抗體(ti) 夾心法適用於(yu) 測定二價(jia) 或二價(jia) 以上的大分子抗原，但不適用於(yu) 測定半抗原及小分子單價(jia) 抗原，因其不能形成兩(liang) 位點夾心。