α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒

商品詳情：
α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒測定意義(yi)

α-KGDH(EC 1.2.4.2)廣泛存在於(yu) 動物、植物微生物和培養(yang) 細胞的線粒體(ti) 中，是三羧酸循環調控關(guan) 鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶。

測定原理

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶生成琥珀酰輔酶、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀(yi) 器和用品

紫外分光光度計/酶標儀(yi) 、水浴鍋、台式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
樣品中AA提取：

1.按照組織質量（g）：試劑一體(ti) 積(mL)為(wei) 1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行室溫勻漿，然後轉移到1.5 mL EP 管中，蓋緊後（防止水分散失）置於(yu) 沸水浴提取15 min；自來水冷卻後，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.細菌或培養(yang) 細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nei) ，離心後棄上清；按照細菌或細胞數量（104個(ge) ）：試劑一體(ti) 積（mL）為(wei) 500~1000：1的比例（建議500萬(wan) 細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重複30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.血清等液體(ti) ：直接檢測。

計算公式如下：

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義(yi) ：每mL血清（漿）每分鍾生成1 nmol的對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義(yi) ：每mg組織蛋白每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義(yi) ：每g組織每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義(yi) ：每1萬(wan) 個(ge) 細菌或細胞每分鍾生成1 nmol 對硝基苯胺定義(yi) 為(wei) 一個(ge) 酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應體(ti) 係總體(ti) 積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光係數，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體(ti) 積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體(ti) 積，1 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；2000：細菌或細胞總數，2000萬(wan) 。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標準品均需臨(lin) 用前配製，且避光保存，配製好未使用完的4℃保存且3天內(nei) 使用完畢。

2. 為(wei) 保證實驗結果的準確性，需先取1-2個(ge) 樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高於(yu) 2.5），用蒸餾水稀釋後再測定。

3. 與(yu) 茚三酮反應在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結果不含這兩(liang) 種氨基酸的量。

4．檢出限為(wei) 100μmol/L。

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